無乳鏈球菌疫苗研究新進展

歐陽月紅 周乾云 許諾

【摘 要】：無乳鏈球菌（GBS）是一種引起人畜共患病的病原菌，具有跨物種感染的潛在能力，可以在新生兒、孕婦、免疫力低下者及牛、狗、嚙齒動物、魚類等宿主體內適應生存，并引發相關疾病。目前，在西歐、亞洲、非洲、南美洲各國中已有發現大量人和動物被無乳鏈球菌感染的病例。疫苗是一種預防傳染病的有效手段，但目前仍未有人用或畜用的GBS疫苗上市。本文就GBS對人類與動物的危害、GBS防治策略和人用及獸用無乳鏈球菌疫苗研發最新進展進行總結，為國內無乳鏈球菌病的防治工作及無乳鏈球菌疫苗的研發提供參考。

【關鍵詞】：無乳鏈球菌;人畜共患菌;疫苗

【中圖分類號】R843【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2019）09-03--01

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性雙球菌，又名B群鏈球菌（Lancefield group B streptococcus，GBS），最早在患乳腺炎的奶牛身上分離出來[1]。本文就人類所發現GBS對人畜的危害、GBS防治策略和GBS疫苗研制的最新進展進行討論和探討，希望能拋磚引玉借此引起相關研究人員以及政府有關部門對無乳鏈球菌病這一人畜共患疾病的重視，積極參與并推動對人用及畜用無乳鏈球菌疫苗研發工作，盡快實現無乳鏈球菌疫苗研制工作的突破。

1 無乳鏈球菌的概況

無乳鏈球菌，屬于硬壁菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、乳桿菌目（Lactobacillales）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、鏈球菌屬（Streptococcus sp），被歸為B群鏈球菌，且是唯一擁有B群特異性抗原的鏈球菌。GBS最早由Nocard和Mollereau于1887年在牛體內發現[2]，后來，Lancefield和 Hare于1935年在產婦的陰道拭子中發現了GBS，1938年，FILE描述了產后婦女的三例死亡病例。

無乳鏈球菌是一種在自然界廣泛存在的兼性厭氧革蘭氏陽性細菌。利用光學顯微鏡進行觀察，可發現單個無乳鏈球菌呈現為直徑在0.6～1.0μm的球形或卵圓形，呈現雙球狀或鏈狀。在培養時，大多數無乳鏈球菌在36～37℃和pH 7.4～7.6的條件下生長最佳。無乳鏈球菌的培養需要血清瓊脂培養基、腦心浸液培養基（BHI）等類的高營養培養基。在溶血性方面，大部分無乳鏈球菌呈現β-溶血，α或γ-溶血則是小部分。

2 無乳鏈球菌對人類及動物的危害

GBS是一種人畜共患病病原菌，可以在新生兒、孕婦、體質弱者如老年人和艾滋病患者及牛、狗、嚙齒動物、魚類等宿主體內適應生存，并引發相關疾病。世界衛生組織于2014年召開的疫苗產品開發咨詢委員會（Vaccine Product Development Advisory Committee，PDVAC）第一次會議上，將GBS確定為導致全世界疾病負擔沉重的重要病原體，并被確定為研制疫苗的高度優先選項。

3 無乳鏈球菌病的主要防治措施

目前針對GBS，人們可以采取抗生素、中草藥及疫苗三方面的防治舉措，其中，抗生素防治GBS感染是實際所采用的，但后兩項舉措則還處于試驗研究階段。

抗生素防治GBS，主要采用青霉素、紅霉素和克林霉素等，此法無論在人群中或是動物群體中都是防治GBS感染的主要措施。在國外，產前抗生素策略是現今通用預防GBS的策略，但此策略只能降低早發新生兒GBS的發生率，但對晚發GBS感染無影響，對孕婦疾病的影響有限[1]。然而，抗生素的大量與長期使用將會導致藥物殘留、引起機體內正常菌群的紊亂及產生耐藥菌等危害，所以此方法非長久之計。近年來，研究表明，人類體液及動物組織中的GBS抗生素的耐藥性呈上升趨勢[3]。中草藥中的有效抑菌成分對GBS具有一定的防治效果，研究發現，將從迷迭香、穿心蓮、博落回、紫草、田基黃、田七須和五倍子等中草藥的有效成分添加至飼料中投喂羅非魚，這可以提高羅非魚在GBS攻毒實驗中的存活率[4]。

與抗生素相比，中草藥具有價格低廉，毒副作用少，不產生抗藥性等優勢，但其免疫防治效果明顯小于抗生素與疫苗，尤其在面對一些強毒性及侵襲性病菌的感染時根本無法有效地發揮預防作用。與抗生素和中草藥相比，采用疫苗防治GBS雖然在成本較高，但卻具有特異性，可有效防御強毒性侵襲性病菌，且不產生耐藥性，故采用疫苗防治GBS才是可持續發展的良策。

4 無乳鏈球菌疫苗

目前研制的GBS疫苗都屬于預防性疫苗，治療性GBS疫苗尚未被研制出來。不同類型的疫苗，其研制的依據存在差異。GBS滅活疫苗、GBS弱毒疫苗、GBS多糖-蛋白結合疫苗和GBS菌蛻疫苗是基于GBS的血清型研制的;而GBS DNA疫苗和GBS基因工程重組亞單位疫苗的研制則分別依據GBS所具有的毒力基因及毒力基因所表達的蛋白。

疫苗免疫效果的檢測是疫苗研制及評價工作中的關鍵。目前，GBS疫苗的免疫效果的檢測主要通過檢測IgM、白細胞分化抗原CD4和CD8、白介素IL-1、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子TNF-α、核轉錄因子NF-κB等免疫相關基因的表達水平[5]，血清抗體效價[6]，白細胞吞噬能力及相關酶活力（溶菌酶與超氧化物歧化酶）等[7]，或計算相對保護率。

免疫途徑對于疫苗免疫效果的實現具有極大的影響。注射、口服及浸泡是GBS疫苗所常用的三種免疫途徑，其誘導免疫應答反應的能力大小：注射>口服>浸泡。其中，注射具有疫苗用量較少、能引起較大的免疫原性等優點，但存在技術要求較高、損傷宿主機體等缺點，適用于人類、牛、犬等體型較大的易感宿主，口服與浸泡則適用于魚類及蛙類等體型較小的易感宿主。因此，研制口服型疫苗目前是水產業使用疫苗的熱點之一。基于動物腸道黏膜免疫系統的深入研究，人們已找到方法去應對口服蛋白類疫苗時因抗原蛋白結構被破壞而失效的困境，即采取微球或微膠囊包埋、乳酸菌活載體表達及運載等方式對免疫原蛋白進行保護，結果表明，這些方法在一定程度上都有效保護了抗原蛋白的結構并使其發揮免疫作用[8]。

4.1 滅活疫苗

滅活疫苗，也稱死疫苗，具有制作簡便、免疫原性易受滅活操作破壞的特點。近年來，GBS滅活疫苗的生產多采用福爾馬林法滅活病原微生物，通常以注射或口服的方式進行免疫[9]。在某奶牛場全群泌乳牛的奶樣，檢測確定奶樣中的主要致病菌為無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌后，制備得無乳鏈球菌乳房炎疫苗，該疫苗對無乳鏈球菌乳房炎具有一定的預防及治療作用。

4.2 減毒疫苗

減毒疫苗，也稱弱毒疫苗、減毒活疫苗，通常通過體外連續傳代，具有良好的免疫原性。GBS減毒疫苗目前采用注射和口服進行接種。2015年，李莉萍等[10]通過體外連續傳代從前期篩選出來具有良好免疫原性疫苗候選菌株HN01中獲得弱毒株YM001，高劑量攻毒實驗表明其對羅非魚具有保護作用。

但因減毒疫苗存在返祖、口服時損傷腸道等缺點，針對口服減毒疫苗引起的腸道損傷，可以通過在飼料中添加黃芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等飼料添加劑，這一類飼料添加劑具有有助于腸道黏膜進行修復的功能。

4.3 新型疫苗

4.3.1 基因工程重組亞單位疫苗

亞單位疫苗，又稱組分疫苗，可以通過兩種途徑獲取，一是通過化學分解或有控性的蛋白質水解方法提取病原微生物的目的蛋白;二是利用基因工程技術（DNA重組）來選擇表達目的蛋白，由此目的蛋白制成的疫苗稱為基因工程亞單位疫苗（subunit vaccine），又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，這是目前生產藥用蛋白的熱門方式，按所用表達宿主的類型主要分為真核表達和原核表達。目前，SIP作為GBS表面蛋白的一種，且在各血清型GBS菌株中具有高度的保守性，因此被作為候選疫苗熱門靶點。實驗室獲取SIP蛋白的手段主要是采用原核表達，其中大腸桿菌（DE3）是表達SIP蛋白的常用菌株[11]。

4.3.2 多糖蛋白結合疫苗

多糖結合疫苗是以是以病原菌莢膜多糖為抗原成分，以具有T細胞依賴性的蛋白質抗原為載體，將兩者通過化學方法結合而成的疫苗。因為多糖結合疫苗具有成分均一，安全性較高，對全年齡段的人群都具有較好的免疫原性，且能夠發揮長期持久的保護力，多地接種統計數據表明接種多糖結合疫苗在預防肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌所導致的疾病方面效果顯著。

因此，多糖結合疫苗是人用疫苗研發的熱點。目前，已進入臨床試驗的人用GBS疫苗基本上都是為多糖蛋白結合疫苗。2016年， Madihi等研究表明一種產婦CRM197-三價B群鏈球菌疫苗（血清型Ia、Ib和III）在非孕婦和孕婦中具有良好的耐受性，并可誘導囊膜特異性c抗體反應。同年，有報道稱三價糖結合GBS疫苗在感染艾滋病毒孕婦中的免疫原性低于未感染的孕婦。

4.3.3 DNA疫苗

基因免疫或核酸免疫，是指將含有編碼特定抗原蛋白的基因序列克隆至合適的質粒載體上，制備成核酸表達載體，通過肌肉注射等方式將其導入機體內，通過宿主的表達系統合成抗原蛋白，從而激發機體免疫系統產生特異免疫應答反應。基因免疫過程中所使用的重組DNA表達質粒就是DNA疫苗。

4.3.4 菌蛻疫苗

細菌菌蛻（BGs）是通過PhiX 174裂解基因E在革蘭氏陰性菌中表達出跨膜孔道蛋白，在其組裝至細胞膜上后，導致細胞內容物經該孔道喪失而產生的包膜結構。因其保留了完整的包膜抗原，且無生命，所以成為一種新型的候選疫苗及遞送系統，具有兼顧組合抗原免疫原性、佐劑效應、靶向性載體的作用，同時具有加工容易，易大規模生產等優勢[12]。

4.4 不同類型疫苗利弊分析

在免疫原性方面，相較于其他疫苗，弱毒疫苗與菌蛻疫苗都因能比較完整地保存病原菌細胞膜結構而具有顯著的優勢，而基因工程亞單位疫苗的免疫原性明顯較差，但可以通過與其他GBS蛋白融合表達、利用乳酸菌作為活載體表達GBS表面蛋白、添加佐劑等方法提高其免疫原性。在免疫應答的激發與持久性方面，弱毒疫苗與DNA疫苗在免疫動物或人類后，能在其體內進行自我增殖與擴散，因而較其他疫苗在受免疫動物體內所激發的免疫應答更具有持久性。此外，弱毒疫苗還具有能激發細胞免疫的特點，因此適用于開發口服型與浸泡型弱毒疫苗，造福于受GBS等病原菌侵襲而受重創的養殖漁業。

在安全性方面，弱毒疫苗存在返毒的風險，菌蛻疫苗則存在失活徹底存在活性病原菌的風險，而基因工程亞單位疫苗和多糖結合疫苗因其成分較為均一不含核酸，在免疫動物或人類后，不會產生持續感染，因此較其他疫苗具有較高的安全性。基因工程亞單位疫苗還具有可規模化擴大生產、可簡便生產多價疫苗、產生的免疫應答能與野毒感染相區分等優勢，既可以作為獸用疫苗，也適用于研發人用疫苗。

5 展望

疫苗是預防侵襲性傳染疾病的有效手段。最近，國家農業部農牧便函[2019]236號文件提出“為了維護動物源食品安全和公共衛生安全，2020年我國將全面禁止抗生素被用于飼料添加劑”的計劃，加快疫苗的研制與投入使用將有利于這項計劃的落實。

鑒于GBS具有跨物種傳播的風險，世界各地防疫站及醫院等機構加強對GBS感染及耐藥性的實時監測與報道，這將有利于GBS疫苗研制工作的跟進。另外為了通過普及GBS感染及防治的知識，以提高GBS疫苗接種率來有效預防GBS感染，這需要借助政府機構或相關社會機構如GBSA （Group B Strep Association US/International） 和 GBSS （Group B Strep Support – UK/EU） [6]。我國目前暫無這樣的宣傳機構，建議政府或GBS相關研究機構能夠積極組建。

參考文獻

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