不同產地苦杏仁藥材及其飲片水提液HPLC指紋圖譜研究

胡祥昊,李亞男，孫志強，高鵬，代龍*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355; 2.山東禹澤藥康產業技術研究院有限公司，山東 德州 251200)

苦杏仁為薔薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim、西伯利亞杏PrunussibiricaL.、東北杏Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne或杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟種子[1],有降氣止咳平喘、潤腸通便的功效，主要含苦杏仁苷、脂肪、蛋白質和多種微量元素[2-3]，其中苦杏仁苷口服進入體內后，在β-葡萄糖苷酶的作用下生成氫氰酸，為鎮咳、平喘的主要藥效成分，同時也是苦杏仁的毒性成分[4-5]。目前已有甲醇超聲提取苦杏仁藥材用于指紋圖譜研究的相關報道[6]，而古代典籍中經典名方大部分采用水煎煮[7]。因此，本實驗采用苦杏仁藥材水提液進行指紋圖譜研究,并對比分析生杏仁與燀杏仁的指紋圖譜，闡明苦杏仁炮制過程中有效成分的傳遞關系，旨在為含苦杏仁的制劑指紋圖譜研究提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津制作所)；十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KDM型可調控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

本實驗所用15批苦杏仁藥材由安徽濟人藥業有限公司提供，采購于山西省運城市萬榮縣等3個不同產地，見表1，經濟南市食品藥品檢驗所主任藥師宋希貴鑒定為薔薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim的干燥種子；苦杏仁苷對照品(批號：110820-201808)采購于中國食品藥品檢定研究院；水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈均為色譜純。

表1 苦杏仁藥材來源信息

2 實驗方法

2.1 色譜條件

采用Kinetex C18(2.6 μm, 100 mm×4.6 mm)色譜柱，流動相為乙腈-水，檢測波長210 nm，流速0.6 mL·min-1, 柱溫20 ℃，進樣量10 μL；流動相梯度洗脫比例見表2。

表2 HPLC梯度洗脫程序表

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取苦杏仁苷對照品10.00 mg，置25 mL容量瓶中，加HPLC級甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品母液。精密量取1 mL母液置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 燀杏仁的制備

取苦杏仁藥材，除去雜質。加10倍量水，煮沸后將苦杏仁倒入沸水中，燀制10 min，撈出，放入冷水中，除去種皮，60 ℃烘干[8]。

2.4 供試品溶液的制備

稱取苦杏仁粉末(過二號篩)約1.0 g，置圓底燒瓶中，加水50 mL， 置電熱套上回流1 h，加水補足減重，趁熱濾過，續濾液過0.45 μm微孔濾頭，即得。

3 實驗結果與分析

3.1 精密度

取同一批苦杏仁藥材供試品溶液，按2.1項下液相條件連續進樣6次，結果見圖1。以圖6b中7號峰為參照峰，結果7個共有峰的相對保留時間、相對標準偏差均小于3%，相對峰面積的相對標準偏差均小于5%，表明儀器精密度良好。

3.2 穩定性

取同一批苦杏仁藥材供試品溶液，按2.1項下液相條件分別在0、3、6、9、12、15 h進樣6次，結果見圖2。7個共有峰的相對保留時間相對標準偏差均小于3%，相對峰面積的相對標準偏差均小于5%，表明15 h內苦杏仁藥材供試品穩定性良好。

圖2 穩定性實驗圖譜匹配結果Fig.2 Chromatogram matching results of the stability test

3.3 重復性

取同一批苦杏仁藥材粉末稱取6份，按2.4項下方法平行制備供試品溶液，按2.1項下條件測定，記錄色譜圖，結果見圖3。結果7個共有峰的相對保留時間相對標準偏差均小于3%，相對峰面積的相對標準偏差均小于5%，表明該方法重復性較好。

圖3 重復性實驗圖譜匹配結果Fig.3 Chromatogram matching results of the repeatability test

3.4 參照峰的選擇

取15批不同產地的苦杏仁藥材，按照2.4項下樣品制備方法平行制備15批樣品，并依次按2.1項下液相條件進行指紋圖譜分析，對比15批藥材的7個共有峰，發現7號峰分離度較好且具有較大的峰面積，因此選擇7號峰作為參照峰。

3.5 指紋圖譜數據分析

通過對15批不同產地苦杏仁藥材的指紋圖譜色譜峰進行分析，共確定了14個共有峰，其中7個共有峰(圖6b)峰形較好，且分離度大于1.5，因此選取7個峰作為共有指紋峰進行方法學考察。分別計算7個共有峰的相對保留時間，其相對保留時間的相對標準偏差均小于3%，符合指紋圖譜的要求。運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統計算可知[9]，15批苦杏仁指紋圖譜(圖4)相似度在0.97～0.99之間(表3)，表明各批次樣品之間具有較高的相似度，不同產地的苦杏仁藥材指紋圖譜差別不大。

圖4 15批苦杏仁藥材指紋圖譜Fig.4 Fingerprint chromatogram of 15 batches of Semen Armeniacae Amarae

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15RS11.0000.9980.9940.9460.9760.9420.9300.9300.9240.9280.9260.9721.0000.9980.9940.982S20.9981.0000.9980.9570.9780.9540.9360.9330.9270.9320.9300.9300.9981.0000.9980.985S30.9940.9981.0000.9610.9740.9550.9380.9320.9260.9320.9320.9280.9940.9981.0000.985S40.9460.9570.9611.0000.9360.9950.9690.9570.9560.9620.9610.9650.9460.9570.9610.981S50.9760.9780.9740.9361.0000.9300.9270.9280.9230.9260.9250.9220.9760.9780.9740.974S60.9420.9540.9550.9950.9301.0000.9610.9510.9470.9530.9530.9630.9420.9540.9550.976S70.9300.9360.9380.9690.9270.9611.0000.9960.9950.9870.9860.9830.9300.9360.9380.980S80.9300.9330.9320.9570.9280.9510.9961.0000.9990.9880.9870.9830.9300.9330.9320.978S90.9240.9270.9260.9560.9230.9470.9950.9991.0000.9900.9900.9840.9240.9270.9260.975S100.9280.9320.9320.9620.9260.9530.9870.9880.9901.0000.9990.9840.9280.9320.9320.977S110.9260.9300.9320.9610.9250.9530.9860.9870.9900.9991.0000.9850.9260.9300.9320.976S120.9270.9300.9280.9650.9220.9630.9830.9830.9840.9840.9851.0000.9270.9300.9280.975S131.0000.9980.9940.9460.9760.9420.9300.9300.9240.9280.9260.9271.0000.9980.9940.982S140.9981.0000.9980.9570.9780.9540.9360.9330.9270.9320.9300.9300.9981.0000.9980.985S150.9940.9981.0000.9610.9740.9550.9380.9320.9260.9320.9320.9280.9940.9981.0000.985R0.9980.9850.9850.9810.9740.9760.9800.9780.9750.9770.9760.9750.9820.9850.9851.000

3.6 生杏仁與燀杏仁HPLC指紋圖譜比較

取15批不同產地的苦杏仁藥材，按照2.3項下制備方法制備15批燀杏仁，并按照2.4項下樣品制備方法平行制備15批樣品，依次按2.1項下液相條件進行指紋圖譜分析，結果見圖5。

通過對苦杏仁藥材與燀杏仁的HPLC指紋圖譜分析(圖6)，結果顯示5、6號峰(圖6b)為生杏仁和燀杏仁的共有峰，且燀杏仁中苦杏仁苷含量遠大于生杏仁，說明燀杏仁中的苦杏仁苷酶在高溫條件下失活，達到了“殺酶保苷”的作用。另外燀杏仁中明顯缺少1、3、7號峰，可能是由于這3個峰為苦杏仁苷水解產物，生杏仁在提取過程中遇水酶解，而燀杏仁由于酶失活，無法酶解生成1、3、7號峰。

圖5 15批燀杏仁指紋圖譜Fig.5 Fingerprint chromatogram of 15 batches of blanched almonds

a苦杏仁苷對照品；b苦杏仁藥材(批號：Y18052801)供試品；c燀杏仁(批號：P18052801)供試品圖6 苦杏仁藥材與燀杏仁高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatogram

4 討論

本實驗采用HPLC法進行苦杏仁藥材指紋圖譜分析，提供了一種苦杏仁藥材水提液指紋圖譜條件。苦杏仁苷在苦杏仁藥材中通常以D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷兩種形式存在，由于D-苦杏仁苷、L-苦杏仁苷化學性質接近，二者的色譜行為也較為一致，因此在HPLC中較難分離[10]。通過對比不同型號色譜柱的分離效果，發現Kinetex C18(2.6 μm,100 mm×4.6 mm)色譜柱對L-苦杏仁苷(圖6b 5號峰)和D-苦杏仁苷(圖6b 6號峰)有較好的分離效果。通過考察不同流速和柱溫，發現在流速0.6 mL·min-1、柱溫20 ℃條件下，圖譜中1、2號峰能夠達到基線分離。

15批不同產地的苦杏仁藥材色譜峰中，共有7個共有峰。方法學考察結果顯示其精密度、穩定性、重復性相對保留時間的相對標準偏差均小于3%，相對峰面積的相對標準偏差均小于5%，表明該方法準確、可靠、重復性良好。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統結果顯示具有較好的相似度。通過對比生杏仁與燀杏仁的HPLC指紋圖譜，發現燀杏仁中5、6號峰苦杏仁苷含量明顯高于生杏仁，且缺少1、3、7號峰，推測是由于生杏仁中含有苦杏仁苷酶，導致苦杏仁苷在提取過程中遇水酶解未生成1、3、7號峰。本實驗所建立的色譜條件能夠為苦杏仁藥材質量控制標準的建立及含苦杏仁的復方制劑質量控制提供參考。