扳機日血清孕酮升高在不同卵巢反應(yīng)人群中與優(yōu)胚率的相關(guān)性分析

曹 穎 ，劉 嬌 ，張云山

（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，天津300100）

在使用GnRH類似物之前，控制性卵巢刺激（COS）的晚卵泡期經(jīng)常出現(xiàn)早發(fā)性黃體生成素（LH）峰，以致孕酮（P）過早升高，這種現(xiàn)象稱之為“過早黃素化”（premature luteinization，PL）[1]。隨著 GnRH-a 和GnRH拮抗劑（GnRH-A）的應(yīng)用，其對垂體的抑制作用顯著降低了PL的發(fā)生[2]。然而，盡管在COS過程中使用GnRH類似物，晚卵泡期孕酮仍然升高，發(fā)生率為38%[3-4]。不同于PL，血清孕酮提早升高（premature progesterone rise，PPR）是指在IVF周期不存在LH升高的情況下，孕酮在hCG扳機日升高[5]。COS過程中卵泡期PPR的發(fā)生機制及其對輔助生殖技術(shù)（ART）結(jié)局的影響是研究的熱點問題[6-7]。

胚胎的成功植入需要容受性子宮內(nèi)膜和同步發(fā)育的囊胚期胚胎[8]。當晚卵泡期血清孕酮升高時，新鮮周期移植的胚胎種植率和妊娠率均顯著降低[7,9]。這種現(xiàn)象的原因仍存在爭議：胚胎的發(fā)育潛能低下、子宮內(nèi)膜的容受性下降[10]。許多研究報道了孕酮升高對新鮮周期子宮內(nèi)膜環(huán)境有不利影響[11-14]。相反，大多數(shù)現(xiàn)有文獻都沒有提出孕酮升高對胚胎的質(zhì)量和潛能有任何有害影響[5,15-16]。于是，本研究試圖通過大樣本回顧性分析，研究孕酮升高對胚胎質(zhì)量的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2012年1月-2018年4月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院接受IVF-EF治療的不孕癥患者。納入標準：常規(guī)GnRH-a長方案，hCG扳機日抽血檢測血清孕酮值，取卵后第3天至少有一個2PN來源的胚胎。排除標準：年齡＞40，胚胎植入前遺傳學診斷（PGD），卵巢低反應(yīng)（獲卵數(shù)＜4個）[17]，因男方因素不孕而行ICSI的夫婦。根據(jù)獲卵數(shù)是否超過15個分為卵巢高反應(yīng)組和卵巢正常反應(yīng)組。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性卵巢刺激方案 所有患者均在月經(jīng)第2～3天抽查性激素及陰道B超數(shù)竇卵泡數(shù)（AFC），了解卵巢儲備功能。于月經(jīng)第21天行陰道B超，確認卵巢和子宮狀態(tài)正常，隨即開始降調(diào)節(jié)。通過注射GnRH-a（達必佳，0.1 mg/支，輝凌制藥，德國）0.05 mg每日1次抑制垂體功能，用藥10 d后抽查血LH、E2及陰道B超。月經(jīng)第3～5天，當患者達到降調(diào)節(jié)標準后，根據(jù)患者體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、卵巢儲備等情況開始給予促性腺激素（Gn）150～300 U促排。Gn采用注射用重組人促卵泡激素（果納芬，75 IU，默克，美國）和/或重組促卵泡素β注射液（普麗康，100 IU，歐加農(nóng)，荷蘭）和/或注射用尿促卵泡素（麗申寶，75 IU，珠海麗珠，中國）。用藥5天后，根據(jù)卵巢反應(yīng)調(diào)整Gn用量。當兩個優(yōu)勢卵泡達到平均直徑18 mm時，給予hCG 4 000-10 000 U（珠海麗珠）扳機以誘發(fā)排卵。在扳機后34～36 h經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。

1.2.2 血清性激素水平測定 收集月經(jīng)第2～3天和扳機日的血液樣本，采用法國VIDAS全自動熒光免疫分析儀測量血清FSH、P和E2水平。

1.2.3 體外受精-胚胎培養(yǎng) 在禁欲3～5 d后通過手淫將精液收集在無菌容器中，然后在37℃環(huán)境中存放30 min。液化后，根據(jù)世界衛(wèi)生組織標準[18]分析樣本的精子濃度、活力和形態(tài)，并采用單層密度梯度法或上游法處理精液。將卵母細胞在G-IVF培養(yǎng)基（Vitrolife）中溫育并在取卵后3～4 h受精，受精方式取決于男方精液情況或既往受精情況選擇IVF或ICSI。受精后16～18 h觀察受精情況，正常受精被定義為具有兩個原核（2PN）的受精卵。然后，受精卵在G1培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)。取卵后第3天移植不多于兩個最優(yōu)質(zhì)胚胎，將剩余可移植的胚胎和全胚凍患者的胚胎冷凍保存，用于隨后的FET周期。

1.2.4 胚胎質(zhì)量評分 在第3天根據(jù)本中心胚胎評分標準[19-20]評估所有可移植胚胎的卵裂球數(shù)量、形狀和細胞質(zhì)碎片。卵裂球內(nèi)無碎片，卵裂球大小均等，形狀規(guī)則被評為I級胚胎。卵裂球內(nèi)無碎片，卵裂球大小欠均等，形狀欠規(guī)則或碎片＜10%，卵裂球大小均等，形狀規(guī)則被評為Ⅰ＋級胚胎。將取卵后第3天Ⅰ或Ⅰ＋級、6≤卵裂球數(shù)≤10的胚胎及致密融合的正常受精胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.3 評價指標 該研究的主要結(jié)果是每個受精卵（2PN）來源的優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 19.0版（SPSS Inc.，USA）進行。使用單因素和多因素線性回歸分析來研究IVF/ICSI周期中與優(yōu)質(zhì)胚胎形成率相關(guān)的因素，并且計算Beta（B）相關(guān)系數(shù)和95%置信區(qū)間（CI）。為避免假設(shè)HCG日孕酮水平與優(yōu)胚率呈線性關(guān)聯(lián)所造成的潛在偏倚，根據(jù)hCG扳機日血清孕酮水平將患者分成≤0.9，0.9～1.2，1.2～1.5，1.5～1.8，1.8～2.1，2.1～2.4，＞2.4 ng/mL 共 7 組，并利用非參數(shù)統(tǒng)計的Kruskall-Wallis檢驗分析組間優(yōu)胚率是否存在差異。使用非參數(shù)檢驗（Mann-WhitneyU檢驗）分析組間數(shù)據(jù)。所有的假設(shè)檢驗都是雙側(cè)的，P＜0.05被認為是統(tǒng)計學有意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 本研究共納入5 097個IVF/ICSI周期。參與者的平均年齡為31歲（范圍20～40歲）。不孕癥的臨床適應(yīng)癥包括輸卵管因素、卵巢因素、子宮內(nèi)膜異位癥、男性因素和其它不孕因素。表1列出了所有周期的臨床特征和結(jié)局。

表1 IVF/ICSI周期的臨床特征和結(jié)局Tab 1 Clinical features and outcomes for the IVF/ICSI cycle

2.2 總體結(jié)果 hCG扳機的血清孕酮平均水平為(1.11±0.52)ng/mL。當參與者根據(jù)卵巢反應(yīng)性分組時，卵巢高反應(yīng)組血清孕酮水平顯著高于卵巢正常反應(yīng)組[分別為（1.23±0.55）ng/mL，（0.99±0.46）ng/mL；P＜0.001）] 。

圖1 IVF/ICSI周期扳機日血清孕酮值與優(yōu)胚率之間的關(guān)系Fig 1 Relationship between serum progesterone value on the day of hCG administration and excellent embryo rate in IVF/ICSI cycle

在新鮮IVF/ICSI周期，與優(yōu)胚率有關(guān)因素進行單因素和多因素線性回歸分析，扳機日孕酮值與優(yōu)胚率成負相關(guān)（B：-2.016，95%CI：-3.380～-0.653，P=0.004）。圖1顯示了扳機日血清孕酮水平與優(yōu)胚率之間的關(guān)系，即在新鮮IVF/ICSI周期，隨著血清孕酮濃度的逐漸增加，優(yōu)胚率進行性下降。

2.3 不同卵巢反應(yīng)組扳機日血清孕酮值與優(yōu)胚率之間的關(guān)系

2.3.1 卵巢高反應(yīng)組 與優(yōu)胚率有關(guān)因素的相關(guān)分析（表2）表明，優(yōu)胚率與年齡、BMI、不孕時間、基礎(chǔ)FSH、Gn天數(shù)、扳機日E2值、獲卵數(shù)無顯著相關(guān)性。相比之下，優(yōu)胚率與Gn用量、扳機日孕酮值和受精率顯著相關(guān)。

表2 卵巢高反應(yīng)組與優(yōu)胚率有關(guān)因素的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis between factors and excellent embryo rate in high ovarian response group

圖2 卵巢高反應(yīng)組扳機日血清孕酮值與優(yōu)胚率之間的關(guān)系Fig 2 Relationship between serum progesterone value and excellent embryo rate in high ovarian response group

圖2 顯示了卵巢高反應(yīng)組（n=2 582）扳機日血清孕酮值與優(yōu)胚率之間的關(guān)系。在IVF/ICSI周期，優(yōu)胚率隨著血清孕酮濃度的增加而逐漸下降。當扳機日血清孕酮值處在 1.8～2.1、2.1～2.4、＞2.4 ng/mL 時，優(yōu)胚率均顯著低于（P＜0.05）扳機日孕酮值≤0.9ng/mL。然后以扳機日孕酮值1.5、1.8、2.1 ng/mL為界分成兩組，只有以1.8 ng/mL分組時優(yōu)胚率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖 3）。所以，對于高反應(yīng)人群來說，扳機日血清孕酮值1.8 ng/mL可能就是優(yōu)胚率發(fā)生急劇下降的閾值。

圖3 卵巢高反應(yīng)組兩組優(yōu)胚率的比較Fig 3 Comparison of the rate of excellent embryos between the two groups in high ovarian response

2.3.2 卵巢正常反應(yīng)組 在IVF/ICSI周期進行與優(yōu)胚率有關(guān)因素的相關(guān)性分析（表3），結(jié)果表明優(yōu)胚率與Gn用量、扳機日孕酮值水平和受精率顯著相關(guān)，而與年齡、不孕時間、BMI、基礎(chǔ) FSH、Gn 天數(shù)、扳機日E2值和獲卵數(shù)無顯著相關(guān)性。

隨著血清孕酮濃度的逐漸增加卵巢正常反應(yīng)組（n=2515）優(yōu)胚率進行性下降（圖4）。當扳機日血清孕酮值＞1.5 ng/mL時，每組優(yōu)胚率均顯著低于（P＜0.05）扳機日孕酮值≤0.9 ng/mL。同理，以扳機日孕酮值1.2、1.5、1.8 ng/mL為界分成兩組，比較兩組優(yōu)胚率，只有以1.5 ng/mL分組時差異有顯著性（P＜0.05）（圖 5）。所以，在正常反應(yīng)人群，扳機日血清孕酮值1.5 ng/mL可能就是優(yōu)胚率顯著下降的閾值。

表3 卵巢正常反應(yīng)組與優(yōu)胚率有關(guān)因素的相關(guān)性分析Tab 3 Correlation analysis between factors and excellent embryo rate in normal ovarian response group

圖4 卵巢正常反應(yīng)組扳機日血清孕酮值與優(yōu)胚率之間的關(guān)系Fig 4 Relationship between serum progesterone value and excellent embryo rate in normal ovarian response group

圖5 卵巢正常反應(yīng)組兩組優(yōu)胚率的比較Fig 5 Comparison of the rate of excellent embryos between the two groups in normal ovarian response

3 討論

這項超過5 000例IVF/ICSI周期的回顧性研究顯示，不管卵巢反應(yīng)性如何，hCG扳機日血清孕酮水平升高與優(yōu)胚率進行性下降相關(guān)。卵巢反應(yīng)性不同，優(yōu)胚率顯著下降時的血清孕酮閾值濃度不同：我們建議在hCG扳機日血清孕酮水平為1.5 ng/mL作為卵巢正常反應(yīng)的閾值；在卵巢高反應(yīng)人群，當血清孕酮水平＞1.8 ng/mL，優(yōu)胚率顯著下降。這些發(fā)現(xiàn)意味著孕酮閾值濃度的升高與卵巢反應(yīng)性增加有關(guān)。

雖然孕酮升高對胚胎質(zhì)量的影響還有待進一步證實，但已有動物研究發(fā)現(xiàn)了孕酮介導的對卵母細胞潛能的調(diào)節(jié)[21-22]。胚胎質(zhì)量的這些差異是否導致著床率和妊娠率的降低值得進一步探究。事實上，以前的研究表明，新鮮周期扳機日孕酮升高采取全胚凍方法（freeze-all strategy），隨后進行凍融胚胎移植也能獲得較好的妊娠率和活產(chǎn)率[7,23]，提示PPR的主要不利影響是新鮮周期子宮內(nèi)膜容受性。然而，已發(fā)表的研究主要關(guān)注第一次凍融胚胎移植的妊娠率，而不是累積妊娠率[7]。因此，PPR對所有胚胎是否有潛在不利影響還有待研究。最近，一些大樣本回顧性研究發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量胚胎形成率和高質(zhì)量囊胚形成率與扳機日孕酮升高成負相關(guān)，而與女性的年齡、基礎(chǔ)FSH、促性腺激素的總劑量和卵巢刺激時間無關(guān)[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)反復IVF失敗的女性更容易發(fā)生PPR[26]，間接表明hCG扳機日孕酮升高可能與卵母細胞因素有關(guān)。此外，一些回顧性研究發(fā)現(xiàn)孕酮水平升高對累積妊娠率或累計活產(chǎn)率有不利影響[27-28]。雖然以前有少量研究專注于胚胎質(zhì)量，但納入研究的患者過少，不能排除偏倚的存在和檢驗效能不足的影響。本文通過大樣本數(shù)據(jù)回顧性分析，進一步有力地支持扳機日孕酮升高不利于胚胎質(zhì)量。

對子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生不利影響的晚卵泡期孕酮閾值濃度為1.5 ng/mL[11]，與卵巢反應(yīng)性無關(guān)。然而，PPR對新鮮周期妊娠率的影響與卵巢反應(yīng)性有關(guān)[29]。在卵巢高反應(yīng)人群，新鮮周期妊娠率顯著下降時的扳機日孕酮值水平高于卵巢正常反應(yīng)和低反應(yīng)人群[30-31]。眾所周知，胚胎質(zhì)量與IVF/ICSI周期結(jié)局直接相關(guān)。因此，筆者認為高孕酮水平通過影響胚胎從而降低妊娠率，而且卵巢反應(yīng)性不同，優(yōu)胚率顯著下降時的血清孕酮閾值濃度不同。

綜上所述，雖然全胚凍能夠避開孕酮升高所帶來的子宮內(nèi)膜容受性降低的影響，但并不能消除對胚胎質(zhì)量的影響。所以，我們并不建議試圖通過大劑量FSH刺激卵巢和/或延長促排時間一次性獲取最多數(shù)量的卵泡。實際上，這可能會增加孕酮升高的機會。減少Gn用量或采用逐步減量法（stepdown protocol）能否減少扳機日孕酮升高的發(fā)生而不影響妊娠率，這還有待進一步的驗證[27]。

總之，本研究表明，優(yōu)胚率的減少與扳機日孕酮升高有關(guān)。在卵巢高反應(yīng)人群，優(yōu)胚率顯著降低時的孕酮值為1.8 ng/mL；在卵巢正常反應(yīng)人群，該孕酮值為1.5 ng/mL。