SOX6在膀胱癌發生發展中的作用及相關機制

付真睿，盛飛，張昌文，常泰浩，陳仕洋，喬寶民

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，美國癌癥協會預估2017年膀胱癌新增病例79 030例，死亡病例16 870例[1]，盡管大多數的膀胱癌為非肌層浸潤性的（70%～75%），但它們會隨著時間的推移而轉移并最終發展為肌層浸潤性疾病（25%～30%）[2]。膀胱癌的治療方法包括手術、化學療法或放射療法，但生存益處仍然有限，其發病率和死亡率在過去10年中逐漸增加[3]。因此，迫切需要提高對膀胱癌的認識并發現可用于治療膀胱癌更有效、高選擇性的潛在治療靶點。SOX6為SOX基因家族D亞族的主要成員之一，SOX家族蛋白作為轉錄因子主要參與調控胚胎發育、性別決定、神經生長、血管生成、骨骼形成、干細胞形成等生長發育過程[4-5]，近年來，越來越多的研究表明SOX6的異常表達與許多腫瘤相關[6-12]。蛋白酶體作為細胞蛋白質的一種降解途徑，很多疾病發生發展也與之直接相關。蛋白酶體作為新型抗腫瘤藥物的一個重要靶標，當蛋白酶體活性受到抑制后，其相關受體蛋白的降解受到抑制[13-15]。對SOX6通過蛋白酶體途徑影響膀胱癌生長進程的機制研究將有助于提升筆者對膀胱癌的認識和治療。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人膀胱癌組織與癌旁組織獲取于天津醫科大學第二醫院泌尿外科，膀胱癌細胞系（T24、BIU-87、EJ、5637）和正常膀胱上皮細胞（SVHUC-1）來自天津醫科大學第二醫院泌尿外科研究所。兔單抗SOX6、兔單抗E-cadherin、兔單抗Vimentin、一抗兔單抗GAPDH、二抗羊抗兔購于proteintech公司，SOX6高表達質粒 pcDNA3.1-SOX6和空載質粒購于廣東復能基因公司。X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent轉染試劑購于美國Roche公司，CCK8試劑盒、免疫組化試劑盒、多聚甲醛、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Solarbio公司，Transwell小室購于美國Corning公司，ECL顯影液、SYBR Green預混液、蛋白Marker購于美國Thermo Fisher公司，細胞凋亡試劑盒、caspase3試劑盒、RNA反轉錄相關試劑購于康為世紀公司，Matrigel基質膠購于美國BD公司，Trizol試劑購于Invitrogen公司，20 s蛋白酶體檢測試劑盒購于Sigma-Aldaich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 人膀胱癌細胞系培養于含10%FBS的RPMI 1640培養液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養。每2～3d更換培養液1次，待細胞生長融合率達到80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1：2進行傳代培養。取對數生長期，狀態良好的膀胱癌細胞于6孔板中，待細胞長至50%時按轉染試劑說明書進行轉染。

1.2.2 免疫組化 組織標本以10%甲醛液固定24 h，常規石蠟包埋，制備4 μm切片，貼附于涂有APES處理的載玻片上，85℃烤片90 min，免疫組織化學染色：（1）石蠟切片脫蠟；（2）3%H2O2室溫孵育5～10 min，以清除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 min；（3） 微波抗原修復；（4）5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，分別滴加一抗工作液，37℃孵育 1～2 h，PBS沖洗，5 min×3次；（5）滴加生物素標記的二抗，37℃孵育 20～30 min，PBS沖洗，5 min×3 次；（6）滴加辣根酶標記鏈酶卵白素，37℃孵育20～30 min，PBS沖洗，5 min×3 次；（7）DAB 顯色；（8）自來水充分沖洗、復染、封片。用已知陽性標本作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.3 Western blot提取細胞總蛋白 用BCA法測定蛋白濃度，取30～40 μg總蛋白上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉搖床上室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST溶液洗3次，每次15 min。HRP標記的二抗按照1∶1 500稀釋，室溫下孵育1 h，使用TBST溶液洗3次，每次15 min，滴加顯色劑，置于曝光儀內顯影。

1.2.4 熒光實時定量PCR（qRT-PCR） 使用Trizol試劑法提取細胞RNA，使用核酸定量分析儀測定RNA濃度，反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，再使用熒光定量PCR分析儀對cDNA進行擴增檢測，以GAPDH為內參，反應程序如下：94℃3 min（預變性），94℃30 s（變性），56℃ 30 s（退火），72℃60 s（延伸），72℃ 5 min（最后延伸），42～45個循環。反應完成后軟件分析結果（表1）。

表1 突變引物對Tab 1 Mutation primers

1.2.5 Transwell實驗 實驗參照Transwell 24孔板（美國Corning公司）說明書操作。胰酶消化收集細胞，應用含0.5%血清的培養基重懸細胞，接種細胞于鋪好Matrigel基質膠的Transwell小室，使細胞數為2×104個/孔，下室加入500 μL含10%血清的培養基。37℃培養箱中孵育24 h后，移去培養液，用乙醇棉簽擦拭去除小室底膜內側細胞，小心取出上室，用預冷的50%甲醇固定10 min，PBS清洗3遍，結晶紫染色10 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察5個視野的細胞數。

1.2.6 細胞劃痕實驗 處理后的單細胞懸液接種于6孔板內，待培養細胞至90%,用20 μL移液槍頭垂直劃痕，無菌PBS沖洗懸浮細胞及碎片2次，培養24h后，倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況。

1.2.7 細胞凋亡 實驗細胞轉染48 h后不含EDTA胰酶消化后，300 r/min，4℃離心5 min收集細胞，按照細胞凋亡試劑盒說明書加入結合緩沖液、AnnexinV和PI，6h內在流式細胞儀上檢測凋亡指數。

1.2.8 CCK-8實驗 96孔板中加入100 μL細胞懸液，將培養板在培養箱中預培養24 h，在0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱孵育1～4 h，酶標儀讀取待測樣品和空白對照在450 nm處的OD值，將各待測樣本的OD值記為測量值，空白對照的OD值記為空白值，則實際數值=測量值-空白值。

1.2.9 20 s蛋白酶體活性檢測實驗 避光96孔板中加入 90 μL（8×104）處理過的細胞，800 r/min 離心2 min，按說明書加入相關試劑，37°C，5%CO2過夜，在全波長多功能酶標儀上發射波長490 nm檢測吸光度。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析。實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌中SOX6表達水平 與癌旁組織相比膀胱癌組織中的染色強度顯著減弱，可見SOX6蛋白表達在膀胱癌組織中明顯降低。使用Western blot和qRT-PCR分別檢測膀胱癌細胞和正常膀胱上皮細胞內SOX6蛋白水平與mRNA水平表達情況，結果顯示膀胱癌細胞中SOX6的表達顯著降低，在EJ和5637細胞尤其明顯（圖1）。

圖1 SOX6在組織和細胞器中的表達情況Fig 1 The expression of SOX6 in tissues and cells

2.2 SOX6抑制膀胱癌侵襲和遷移能力 Transwell實驗（圖2）和劃痕實驗（圖3）結果顯示，與對照vector組相比，高表達SOX6后的EJ和5637細胞的侵襲能力顯著下降。同時，上皮間質轉化（EMT）的分子標記物E-cadherin蛋白表達升高，Vimentin表達減低（圖4）。

圖2 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的侵襲能力的影響（40×）Effect of up-regulation SOX6 on invasion of EJ and 5637 (40×)

圖3 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的侵襲能力的影響（40×）Fig 3 Effect of up-regulation SOX6 on migration of EJ and 5637(40×)

圖4 SOX6表達增加對膀胱癌的上皮間質轉化的影響Fig 4 Influence of up-expression SOX6 onEpithelial-mesenchymal transition(EMT)of bladder cancer cells

2.3 SOX6抑制膀胱癌的增殖和促進凋亡 CCK-8實驗和流式細胞術結果表明，與對照vector組相比，SOX6表達增加后能夠抑制膀胱癌細胞EJ和5637的增殖，并且能夠促進膀胱癌的凋亡，同時細胞caspase3的活性顯著增加（圖5）。

2.4 SOX6能夠通過蛋白酶體途徑影響膀胱癌的進程 與正常膀胱上皮細胞相比膀胱癌細胞EJ與5637的20 s蛋白酶體的活性相對增加，在膀胱癌細胞中調高SOX6的表達量后，20 s蛋白酶體的活性顯著減低（圖6）。

圖5 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的凋亡和增殖能力影響Fig 5 Influence of up-expression SOX6 on apoptosis and proliferation of EJ and 5637

圖6 SOX6表達增加對膀胱癌EJ和5637細胞的20 s蛋白酶體活性的影響Fig 6 Influence of up-expression SOX6 on the activity of 20 sproteasome of EJ and 5637

3 討論

SOX6作為多功能轉錄因子，主要調節組織分化并參與多種惡性腫瘤的發生發展。研究表明，SOX6的表達量與食管癌的預后顯著相關，通過上調p53和p21WAF1/CIP1抑制食管癌的致瘤能力[8]。在胰腺癌中，SOX6通過抑制上皮間質轉化和AKT通路抑制腫瘤的增殖和侵襲[9]。SOX6的表達抑制卵巢癌的增殖、侵襲、移植瘤生長和血管生成[6]。但是，SOX6和膀胱癌的關系目前還不清楚。

近年來，對于蛋白酶體的研究日益漸增，蛋白酶體作為一個多亞基大分子復合物，具有多種催化功能，能選擇性降解細胞內的蛋白質，是細胞新陳代謝的一個重要組成部分[16]。相對于正常的細胞，腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑更加敏感，通過影響腫瘤細胞的相關通路從而抑制腫瘤細胞，同時，多種腫瘤中的蛋白酶體處于高活性狀態[17]。因此，蛋白酶體漸漸成為抗腫瘤藥物的一個靶點，當蛋白酶體活性被抑制時，腫瘤抑制蛋白p53的含量增加，促進細胞凋亡；免疫相關蛋白降解減少，免疫監視能力增加。

在本研究中，筆者發現了與膀胱的正常組織相比，膀胱癌中SOX6處于低表達狀態，在體外實驗中，通過增加SOX6的表達，發現膀胱癌的增殖、侵襲、遷移能力下降，凋亡增加。并進一步驗證了蛋白酶體在膀胱癌中的活性情況，通過調高SOX6，意外發現膀胱癌細胞中的蛋白酶體活性減低。SOX6可能通過抑制蛋白酶體活性從而調節膀胱癌的腫瘤行為，在聯合蛋白酶體抑制劑治療膀胱癌方面有很好的前景。