C1QL1蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

胡 源 ，許戈良 ，莢衛(wèi)東 ，潘婷婷 ，余繼海 ，黃 玫 ，周杭城

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）肝臟外科，合肥230001；3.肝膽胰安徽省重點實驗室，合肥230001；4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）病理科，合肥230001）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第5位，死因高居第3位[1]；在我國，本病年死亡率占腫瘤死亡率的第2位；肝癌患者的發(fā)病年齡大多為40～50歲，男性比女性多見。肝癌由于其惡性程度高，對放化療不敏感，早診早治（以手術(shù)切除為主的綜合治療）是提高肝癌長期治療效果的關(guān)鍵所在。

影響肝癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的因素是多方面的,C1QL1基因是C1q蛋白質(zhì)家族的一員，C1QL1是C1q-like的一種小的分泌蛋白，幾乎完全在腦中表達(dá)，C1q-like（C1QL）-1、-2、和-3 蛋白質(zhì)是由在大腦中高度表達(dá)的同源基因編碼的，有研究表明目前C1QL1已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中呈過度表達(dá)可能被作為結(jié)直腸癌預(yù)后的一種生物標(biāo)記[2]，且也有研究表明，C1QL1在分化型甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中存在差異性表達(dá)，C1QL1可以作為分化型甲狀腺癌的生物標(biāo)志物之一，并與CRABP1及LCN2共同預(yù)測分化型甲狀腺癌的甲狀腺外擴散[3]，對甲狀腺癌的診斷及預(yù)后具有重要的臨床意義，但C1QL1在HCC中的表達(dá)及其臨床意義仍有待研究，本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測、Western blot檢測及qRT-PCR實驗檢測C1QL1在HCC組織中的表達(dá)情況，并探討其高表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展、惡性程度及臨床病理關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年4月-2011年10月于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）肝臟外科經(jīng)病理確診的HCC患者腫瘤組織石蠟切片共80例作為實驗組，相對應(yīng)的癌旁組織作為對照組。術(shù)后均經(jīng)病理結(jié)果證實均為HCC，臨床病歷資料完整且術(shù)前患者均未行化療、放療及介入等其他相關(guān)輔助治療。男性患者55例，女性患者25例，年齡20～74歲；HBsAg陽性患者44例，陰性患者36例；有血管侵犯（鏡下癌栓或肉眼癌栓）45例，無血管侵犯35例；腫瘤的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)采用美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第八版標(biāo)準(zhǔn)[4]，I～I(xiàn)I期者 46 例，III～I(xiàn)V 期者34例；腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)采用Edmondson分級法，其中Ⅰ～Ⅱ級53例，Ⅲ～Ⅳ級27例。另外收集2017年10月—2018年4月于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）肝臟外科行HCC切除術(shù)的新鮮冷凍HCC組織及其相對應(yīng)的癌旁組織共20對，將標(biāo)本放置-80℃冰箱冷凍保存，行Western blot及qRT-PCR實驗檢測。所選患者術(shù)后均未行放療、化療、介入等其他輔助治療。

1.2 主要試劑 C1QL1抗體（美國SIGMA公司）；通用山羊抗鼠/兔二抗PV-6000（北京中杉金橋公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）；蘇木素染色劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 所有常規(guī)石蠟包埋的組織，4 μm連續(xù)切片后，進(jìn)一步做免疫組織化學(xué)染色。（1）將石蠟切片于60℃烤箱烘烤20 min于2次二甲苯溶液分別浸泡10 min，以充分脫蠟；再分別于 100%、95%、75%的梯度乙醇浸泡 5 min；（2）自來水沖洗浸泡5 min后放入檸檬酸鹽緩沖液中，用高壓鍋煮沸修復(fù)抗原，3%H2O2孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；（3）PBS緩沖液沖洗后滴加兔抗人C1QL1（1：50）特異性抗體，放置 4 ℃冰箱孵育過夜；（4）次日PBS緩沖液沖洗后滴加二抗于37℃孵育30 min；（5）PBS緩沖液沖洗后DAB顯色劑進(jìn)行顯色；滴加蘇木素復(fù)染，再分別于75%、95%、100%梯度的乙醇溶液浸泡2 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3.2 免疫組化染色結(jié)果評分標(biāo)準(zhǔn) （1）根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分[5]：C1QL1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核，在組織切片中胞質(zhì)染為高于背景的淡黃、黃色、棕黃色者為陽性反應(yīng)細(xì)胞。每張切片隨機選擇5個400倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，得出陽性細(xì)胞百分比并賦分：＜10%陽性細(xì)胞為0分，11%～30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分；（2）另外根據(jù)染色細(xì)胞強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。每張切片最終分?jǐn)?shù)為上述兩種評分的乘積（即著色細(xì)胞所占百分比分?jǐn)?shù)×著色細(xì)胞強度），分?jǐn)?shù)≥5分定為高表達(dá)，得分＜5分定為低表達(dá)。以上結(jié)果均由同一位病理專科醫(yī)師獨立閱片并評分。

1.3.3 Western blot檢測 分別將收集的HCC與癌旁組織樣本進(jìn)行充分裂解，并采用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的測定，將每對蛋白樣本進(jìn)行等量上樣，上樣量為50 μL，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉搖床上室溫封閉1 h，加入 C1QL1一抗（1：500），4℃孵育過夜,TBST洗膜3次，洗滌后加入二抗（1：10 000），室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST洗滌后顯色、定影，使用Alpha-Ease FC成像系統(tǒng)（Alpha Innotech，美國）觀察。并對C1QL1蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值進(jìn)行分析，然后計算目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值用于分析C1QL1蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 qRT-PCR實驗檢測 使用TRIzol試劑盒對HCC及相對應(yīng)癌旁組織的總RNA進(jìn)行提取，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：首先95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s后60℃退火1 min；共40個循環(huán)，所有樣本基因均進(jìn)行3次重復(fù)。C1QL1引物正向序列：5′-GGG TTA CGA GGT ACT CAA GTT TG-3′，反向序列：5′-AAA GTA GGT GCC GGG AAT GTT-3′；內(nèi)參設(shè)置為 ACTIN，正向序列：5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′，反向序列 5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′，表達(dá)水平使用 2-ΔΔCt進(jìn)行計算。

1.4 臨床病理指標(biāo) 腫瘤的早期復(fù)發(fā)認(rèn)為是手術(shù)切除腫瘤后2年內(nèi)復(fù)查發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)灶或者肝外轉(zhuǎn)移灶。腫瘤大小選取腫瘤最大直徑；血管侵犯是指鏡下癌栓或肉眼癌栓；腫瘤包膜的完整性是指腫瘤組織的切面與周圍正常組織是否分界清楚[6]；肝癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第8版標(biāo)準(zhǔn)[4]；腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)采用Edmondson分級法[7]。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理使用 SPSS24.0軟件及Graph-Prism5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，本研究中所涉及的分類變量通過χ2檢驗或Fisher精確概率算法檢驗；通過Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線；定量資料以±s表示，使用t檢驗方法進(jìn)行比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C1QL1在HCC及癌旁組織中的表達(dá) C1QL1主要表達(dá)于HCC細(xì)胞質(zhì)中（圖1），高表達(dá)定義為胞質(zhì)內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒，而間質(zhì)細(xì)胞無染色情況。經(jīng)過統(tǒng)計分析表明，C1QL1在HCC中的陽性高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

圖1 HCC組織和癌旁組織中C1QL1表達(dá)情況Fig 1 Expression of C1QL1 in HCC tissues and paracancer tissues

表1 C1QL1蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（n）Tab 1 Expressions of C1QL1 protein in cancer and paracancer tissues（n）

2.2 C1QL1的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系C1QL1高表達(dá)與患者有無乙肝病史（P=0.021）、腫瘤的大小（P=0.003）、血管侵犯（P=0.003）、TNM 分期（P=0.002）及 Edmondson分級（P=0.002）相關(guān)，而與年齡（P=0.758）、性別（P=0.672）、甲胎蛋白（AFP）（P=0.191）、腫瘤數(shù)目（P=0.877）、Child-Pugh分級（P=0.866）、腫瘤包膜完整程度（P=0.238）和肝硬化程度（P=0.316）均無關(guān)（表 2）。

表2 HCC組織中C1QL1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expressions of C1QL1 in HCC tissues and clinicopathological features

2.3 C1QL1的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存時間的關(guān)系 80例HCC患者中C1QL1高表達(dá)者者55例，低表達(dá)者25例，失訪8例患者（其中5例失訪者為C1QL1高表達(dá)者，3例為 C1QL1低表達(dá)者）。Kaplan-Meier生存分析顯示高表達(dá)者的中位生存期為17個月，低表達(dá)者的中位生存期33個月，經(jīng)Log-Rank檢驗顯示，C1QL1蛋白高表達(dá)患者組與低表達(dá)患者組生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 2。

圖2 肝細(xì)胞癌中C1QL1高表達(dá)、低表達(dá)患者的生存曲線Fig 2 Survival curve of patients with high and low expression of C1QL1 in hepatocellular carcinoma

2.4 Western blot檢測結(jié)果 結(jié)果顯示（圖3），20對標(biāo)本中16（80%）對C1QL1在HCC組織中的蛋白表達(dá)水平明顯高于相對應(yīng)的癌旁組織。C1QL1蛋白在HCC組織中的相對表達(dá)量為1.24±0.05，癌旁組織中的相對表達(dá)量為0.61±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.17，P＜0.001）。

圖3 Western blot檢測癌組織和癌旁組織中C1QL1表達(dá)情況Fig 3 Western blot was used to detect the expression of C1QL1 in HCC tissues and paracancer tissues

2.5 qRT-PCR檢測C1QL1的結(jié)果 結(jié)果顯示（圖4），20對標(biāo)本中17對（85%）C1QL1在HCC組織中的mRNA表達(dá)顯著高于相對應(yīng)的癌旁組織（圖3）。C1QL1在HCC組織中的mRNA相對表達(dá)量為8.62±0.72，癌旁組織中的mRNA相對表達(dá)量為3.03±0.34，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.990，P＜0.001）。

圖4 qRT-PCR分析癌組織及癌旁組織中C1QL1 mRNA的相對表達(dá)量Fig 4 The relative expressions of C1QL1 mRNAin HCC tissues and paracancer tissues analyzed by qRT-PCR

3 討論

HCC是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重危害人類健康。在我國，HCC每年發(fā)病患者數(shù)多達(dá)30多萬，占世界肝癌患者總數(shù)的60%[8]，其發(fā)病率及死亡率均位于所有腫瘤的前列[9]，且肝癌的發(fā)生、發(fā)展是眾多因素共同參與調(diào)節(jié)的過程，目前仍然缺乏高敏感性的早期診斷方法，多數(shù)患者就診時已為中晚期，所以其治愈率及遠(yuǎn)期生存率很低，預(yù)后極差[10]，因此探討發(fā)現(xiàn)肝癌的生物標(biāo)志物對肝癌的早期診斷是非常有意義的。

已有研究表明，C1q-like（C1QL）-1、-2 和-3蛋白質(zhì)是由在大腦中高度表達(dá)的同源基因編碼的，明確了C1QL1、C1QL2和C1QL3的球狀C1q域的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，其每一種結(jié)構(gòu)都是一個三聚體，每一個原聚體都形成一個由10股β鏈組成的卷餅折疊樣結(jié)構(gòu)。此外，C1QL的三聚體可以組裝成與脂聯(lián)素相似的高階寡聚物，其三聚對稱軸上包含4個Ca2+結(jié)合點，以及額外的表面結(jié)合位點。Ca2+在三聚對稱軸上的配位殘基降低了Ca2+的結(jié)合力和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。其研究結(jié)果揭示了C1q/TNF超家族蛋白中C1QLs的獨特結(jié)構(gòu)特征，這些蛋白質(zhì)可能與其大腦的特定功能有關(guān)[11]。C1QL1基因最初被克隆為一種與衰老相關(guān)的基因，這種基因在大腦中被高度表達(dá)，也可能在神經(jīng)元分化中發(fā)揮作用[12],C1QL1基因是C1q蛋白質(zhì)家族的一員，它是由攀緣纖維（CFs）提供的，在小鼠小腦的整個發(fā)育期和成年期，它是一個至關(guān)重要的傳導(dǎo)信號。C1QL1能與大腦特定的血管生成抑制劑3（brain-specific angiogenesis inhibitor3，Bai3）（Bai3是細(xì)胞粘附的G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員）特異性結(jié)合，并在突觸后的浦肯野細(xì)胞上表達(dá)[13-14]。此前已經(jīng)證明[15]，C1QL1與它的受體結(jié)合，即粘附G蛋白偶聯(lián)受體3，控制了攀附體和浦肯野細(xì)胞之間的突觸連接和調(diào)節(jié)成熟的模式[2，14]。目前C1QL1已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中呈過度表達(dá)可能被作為結(jié)直腸癌預(yù)后的一種生物標(biāo)記，且也有研究表明，C1QL1在分化型甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中存在差異性表達(dá)，C1QL1可以作為分化型甲狀腺癌的生物標(biāo)志物之一，并與CRABP1及LCN2共同預(yù)測分化型甲狀腺癌的甲狀腺外擴散[3]，對甲狀腺癌的診斷及預(yù)后具有重要的臨床意義，C1QL1的高表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展、惡性程度、生物學(xué)行為的確切機制尚未明確，它在HCC中的表達(dá)及其臨床意義仍有待研究。

本實驗在C1QL1現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)之上，初步探討分析了C1QL1在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，以及是否存在差異性表達(dá)，并分析其是否與臨床病理相關(guān)特征具有密切相關(guān)性。研究結(jié)果顯示C1QL1在HCC中與癌旁組織中表達(dá)具有差異，同樣與HCC患者有無乙肝病史（P=0.021）、腫瘤的大小（P=0.003）、血管侵犯（P=0.003）、TNM 分期（P=0.002）及 Edmondson分級（P=0.002）相關(guān)，而與年齡（P=0.758）、性別（P=0.672）、甲胎蛋白（AFP）（P=0.191）、腫瘤數(shù)目（P=0.877）、Child-Pugh分級（P=0.866）、腫瘤包膜完整程度（P=0.238）和肝硬化程度（P=0.316）均不相關(guān)，表明C1QL1蛋白可能在HCC的發(fā)生發(fā)展及惡性程度中起到正性上調(diào)作用，提示C1QL1蛋白的高表達(dá)可能與HCC的發(fā)生發(fā)展及惡性程度有關(guān)。

必須承認(rèn)的是，本研究樣本量相對較小，且缺乏C1QL1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平以及體外動物實驗的驗證，目前C1QL1在HCC發(fā)生發(fā)展中作用的具體機制尚未完全明確，更大樣本更深入地研究C1QL1在HCC中的作用機制是非常有必要的。總之，HCC作為一種惡性程度極高、侵襲轉(zhuǎn)移能力極強及預(yù)后較差的消化道惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)時常常已是晚期，失去手術(shù)機會，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量較差，且生存時間較短，本研究提示了C1QL1在HCC組織中表達(dá)的上調(diào)可能與HCC發(fā)生發(fā)展、腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，并有可能成為HCC早期診斷的生物標(biāo)志物以及臨床分子靶向治療的新靶點。