雙丹明目膠囊抑制人臍靜脈內皮細胞增殖有效成分篩選研究

趙洪慶 符超君 孟盼 王宇紅 秦裕輝 張秀麗

摘要：目的? 從雙丹明目膠囊24個入血成分中篩選出抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖的有效成分。方法? 將雙丹明目膠囊24個入血成分標準品均稀釋成終濃度為1、10、100 μg/mL的溶液，分別干預體外培養的HUVEC，采用MTT法檢測細胞存活率，對各成分進行初篩，再對有效成分進行濃度細化，確定有效成分的最佳作用濃度。在此基礎上，采用Hoechst33258熒光染色和流式細胞術檢測各有效成分對HUVEC凋亡的影響。結果? MTT檢測結果顯示，雙丹明目膠囊24個入血成分中4個成分能有效抑制HUVEC增殖（P<0.05），分別為3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷，其最佳作用濃度分別為75、75、50、75 μg/mL;進一步研究發現，上述4個成分均能使HUVEC細胞核固縮、碎裂，數量減少，細胞凋亡率顯著增加（P<0.05），其中以丹參酮ⅡA和芹菜素效果尤為明顯。結論? 3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是雙丹明目膠囊抑制HUVEC增殖、發揮治療糖尿病視網膜病變療效的有效成分。

關鍵詞：雙丹明目膠囊;人臍靜脈內皮細胞;增殖;有效成分篩選;芹菜素;丹參酮ⅡA

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0048-04

Abstract： Objective To screen out the effective components inhibiting the proliferation of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） from 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules. Methods All the 24 standards were diluted to a final concentration of 1， 10， and 100 μg/mL， and the HUVEC were cultured in vitro. The cell proliferation inhibition rate was measured by MTT method， and the components were screened. Concentration refinement was used to determine the optimal concentration of effective components. Hoechst33258 fluorescence staining and flow cytometry were used to detect the effects of various effective components on apoptosis of HUVEC. Results The results of MTT experiment showed that among the 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules， 4 components could effectively inhibit the proliferation of HUVEC （P<0.05）， that were 3-acetate oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin， and the optimal concentrations were 75， 75， 50， and 75 μg/mL， respectively. Further studies found that the above four components could make the nucleus of HUVEC pyknosis， fragmentation， number decreased， and the apoptotic rate increased significantly （P<0.05）， especially the effect of tanshinone ⅡA and apigenin. Conclusion 3-acetyl oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin are effective components of Shuangdan Mingmu Capsules for inhibiting the proliferation of HUVEC and treating diabetic retinopathy.

Keywords： Shuangdan Mingmu Capsules; HUVEC; proliferation; screening of effective components; apigenin; tanshinone ⅡA

視網膜病變是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，發病率高且危害性大，目前尚缺乏有效藥物能完全控制其發生發展。雙丹明目膠囊主治肝腎陰虛、瘀血阻絡所致的糖尿病視網膜病變。前期臨床和基礎研究均表明，雙丹明目膠囊能有效改善糖尿病視網膜病變疾病下血糖血脂紊亂，糾正血液流變異常狀態，降低血管內皮生長因子（VEGF）表達，抑制新血管生成[1-3]。在此基礎上，本課題組對雙丹明目膠囊藥效物質基礎進行了研究，共從該復方中鑒定出102個化學成分及24個主要的入血成分[4-5]。而其中究竟哪些成分發揮著抑制內皮細胞增殖，進而抑制微血管生成的功效，尚未明確。本研究在前期基礎上，以人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）為研究對象，通過采用不同濃度的24個入血成分標準品進行干預，篩選出雙丹明目膠囊的有效成分及作用濃度，以期為明確其藥效物質基礎、確定質量控制標準、闡明體內作用機制奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 藥物和細胞株

所有標準品均購自中國食品藥品檢定研究院，于使用前用甲醇溶解，并用培養基稀釋成所需濃度。HUVEC購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2? 主要試劑與儀器

RPMI1640培養基、胎牛血清、胰酶，美國Gibco公司;MTT粉末，上海碧云天生物技術研究所。CO2培養箱、MK3型酶標儀，美國Thermo公司;5417R低溫高速離心機，德國Eppendorf公司;高內涵細胞成像系統，美國PerkinElmer公司;流式細胞儀，美國BD公司。

1.3? 細胞培養

HUVEC用含10%胎牛血清RPMI1640培養基，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養，每隔2～3 d胰酶消化并傳代，定時更換培養液。

1.4? MTT法檢測細胞存活率

細胞經胰酶消化，調整細胞濃度，8000個/孔接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，棄去培養液。配制不同終濃度待測組分溶液，藥物組每孔加100 μL，同時設置空白組（調零組）和對照組，空白組除不加細胞懸液外其余同藥物組，對照組每孔加100 μL培養基，每組設6個復孔。培養箱中繼續培養24 h后，加入MTT液，避光孵育4 h后，每孔加入DMSO液150 μL，室溫振蕩10 min，于酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光度（A），計算細胞存活率[（A藥物組-A空白組）÷（A對照組-A空白組）]，以每板對照組細胞存活率為1。

1.5? Hoechst33258熒光染色觀察細胞凋亡形態

細胞經胰酶消化后，調整細胞濃度，8000個/孔接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，棄去培養液。加入藥物干預24 h后，取出96孔板，棄去培養液，加入PBS洗滌3次，然后每孔加入Hoechst33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min;孵育完成后，棄去孔內染液，PBS洗2次，采用高內涵細胞成像系統檢測細胞凋亡。

1.6? 流式細胞術檢測細胞凋亡率

藥物干預完成后，消化HUVEC，每組細胞數為1×106個/mL，1000 r/min離心5 min，去除上層液體，加入PBS洗滌2次。加入適量Annexin V-FITC/PI溶液5 μL，4 ℃孵育30 min，流式細胞儀上機檢測，采用Cell Quest軟件分析細胞凋亡率。

1.7? 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較用方差分析。α=0.05為檢驗水準。

2? 結果

2.1? 雙丹明目膠囊各入血成分對人臍靜脈內皮細胞存活率的影響

對雙丹明目膠囊24個入血成分進行篩選發現，3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素、大波斯菊苷能有效抑制HUVEC增殖，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），而同來源于丹參中的隱丹參酮和柳杉酚則有明顯促進HUVEC增殖的作用，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2? 雙丹明目膠囊抑制HUVEC增殖有效成分的最佳濃度

對能明顯抑制HUVEC增殖的4個有效成分進行濃度細化，發現各成分對HUVEC增殖的抑制作用與初篩結果一致，根據梯度濃度下不同有效成分的細胞存活率，確定4個有效成分最佳作用濃度，3-乙酸齊墩果酸為75 μg/mL，丹參酮ⅡA為75 μg/mL，芹菜素為50 μg/mL，大波斯菊苷為75 μg/mL。見表2。

2.3? 雙丹明目膠囊有效成分對HUVEC凋亡形態的影響

Hoechst33258熒光染色結果顯示，對照組HUVEC細胞排列整齊，形態正常，分布均勻，熒光呈暗藍色，無明顯的凋亡特征;經雙丹明目膠囊中有效成分3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素及大波斯菊苷干預后，同一視野下細胞數目明顯減少，細胞分布散亂，部分細胞核碎裂，呈透亮狀，呈現典型的凋亡形態學特征。見圖1。

2.4? 雙丹明目膠囊有效成分對HUVEC凋亡率影響

對照組HUVEC凋亡率僅為0.97%，雙丹明目膠囊各有效成分干預后，細胞凋亡率均顯著上升，差異有統計學意義（P<0.01）。其中，丹參酮ⅡA和芹菜素誘導HUVEC凋亡能力明顯更強，平均凋亡率分別為26.63%、28.31%。見圖2、表3。

3? 討論

雙丹明目膠囊是基于糖尿病視網膜病變之“肝腎陰虛、瘀血阻絡”病機而成方，由女貞子、墨旱蓮、丹參、三七、山萸肉、山藥、牡丹皮、茯苓、紅土茯苓、澤瀉、牛膝11味中藥組成。方中女貞子、墨旱蓮滋補肝腎、明目，為君藥;丹參、三七活血養血、化瘀通絡，山萸肉、山藥補腎養肝、健脾固精，四者共為臣藥;牡丹皮、茯苓、紅土茯苓、澤瀉清肝瀉火、利水消腫，共為佐藥;牛膝活血逐瘀、強筋壯骨且性善下行，可防血氣上逆，為使藥。諸藥合用，共奏益腎養肝、活血明目之功效。

抑制視網膜新生血管生成是治療糖尿病視網膜病變的關鍵，血管內皮細胞增殖、芽生、游走又是血管新生的基礎[6]。HUVEC來源于人臍靜脈，是一種具有干細胞潛能的內皮細胞，抑制HUVEC增殖意味著能減少或阻止新血管的生成，從而能改善糖尿病并發的視網膜、心血管病變等[7]。通過對雙丹明目膠囊24個入血成分文獻調研發現，僅有芹菜素被報道抑制HUVEC增殖的作用[8-9]。本研究每個成分標準品均配制成低、中、高3個濃度，經MTT檢測反復篩選，確定3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷4個成分有明顯抑制HUVEC增殖作用，然后對各個成分進行多濃度摸索，確定了4個有效成分抑制HUVEC增殖的最佳作用濃度。此外，通過Hoechst染色和流式細胞術檢測細胞凋亡發現，上述4個成分均能誘使HUVEC呈凋亡形態，增加其凋亡率，并以丹參酮ⅡA和芹菜素抑制效果最為明顯。

綜上，本研究確定3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是雙丹明目膠囊發揮治療糖尿病視網膜病變功效的有效成分，其中3-乙酸齊墩果酸和芹菜素來自君藥墨旱蓮，大波斯菊苷來自君藥女貞子，丹參酮ⅡA則來自臣藥丹參。本研究確定了雙丹明目膠囊藥效成分，為其質量控制研究提供了依據。

參考文獻：

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[2] 符超君，凌艷君，顏家朝，等.雙丹明目膠囊對糖尿病視網膜病變大鼠血糖血脂及血液流變學的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2018，38（5）：489-492.

[3] 符超君，凌艷君，顏家朝，等.雙丹明目膠囊對糖尿病視網膜病變大鼠視網膜組織低氧誘導因子-1α和核因子-κB表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2018，25（6）：44-47.

[4] 龍紅萍，秦裕輝，劉崢嶸，等.UPLC-Q-TOF法分析雙丹明目膠囊化學成分[J].中成藥，2017，39（7）：1527-1531.

[5] 龍紅萍，秦裕輝，劉崢嶸，等.UPLC-Q-TOF-MS法分析雙丹明目膠囊入血成分[J].中成藥，2017，39（10）：2204-2206.

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