我國牧草種帶真菌研究進展

高晨軒，南志標

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室 / 蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室 /蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020）

牧草種子是草地生態建設與畜牧業生產發展的基礎，隨著我國畜牧業和農業結構調整，退耕還草與栽培草地建設等項目的不斷實施，可以預見在未來我國對牧草種子的需求量巨大[1-2]。同時，種子作為高等植物的繁殖器官會攜帶大量的病原微生物，在這些病原微生物中真菌是對種子質量影響最大的一類微生物[3-4]。病原真菌可以通過多種方式進行傳播(混于種子間、附于種子外部或寄生于種子組織內部)，并且在種子的收獲期、貯藏期與幼苗的生長期均可造成嚴重的危害。種帶真菌能夠降低種子的發芽率并影響種子活力，引起種子的生理生化異常，進而導致種子質量的降低，最終會嚴重影響牧草種子的質量和產量，并造成巨大的經濟損失。種帶真菌除寄生于種子上還會在其他環境(土壤、植物殘體和雜草上)中生存，并且會在環境適宜時再次造成侵染。因此了解種帶真菌，進而采取相應的措施是防治病害的重要手段[5-9]。本文就近年來我國牧草種帶真菌研究加以綜述，以期為種帶真菌的研究提供基礎資料和理論依據，同時也為減少種帶真菌造成的經濟損失提供相關的科學依據。

1 種帶真菌的檢測方法

種帶真菌的分離與檢測是研究種帶真菌進而采取相應防治措施的重要基礎。國際種子檢驗協會(International Seed Testing Association，ISTA) 1993年指出，健康的種子是指種子上的病原微生物存在較少，且種子應具有良好的生理狀態。理想的種帶真菌監測方法應該具有敏感度高、簡捷、經濟等優點[10]。目前常見的種帶真菌檢測方法大致有8種，其特點亦不相同(表1)。

表1 種帶真菌常見的檢測方法Table 1 Common detection methods of seed-borne fungi

2 我國牧草種帶真菌

截至2018年，我國科研工作者共對12種牧草種子的種帶真菌進行了分離研究(表2)，分別為沙打旺(Astragalus adsurgens)、燕麥(Avena sativa)、小冠花(Coronilla varia)、老芒麥(Elymus sibiricus)、偃麥草(Elytrigia repens)、羊草(Leymus chinensis)、多年生黑麥草(Lolium perenne)、苜蓿(Medicago)、紅豆草(Onobrychis viciaefolia)、蘇丹草 (Sorghum sudanense)、紅三葉(Trifolium pratense)和草木樨(Melilotus suaveolens)。其中，豆科牧草6種，禾本科牧草6種。種樣來源包括中國、澳大利亞、丹麥、新西蘭、美國和加拿大共計6個國家。中國的種樣來源包括甘肅、新疆、青海、河北、河南、江蘇、遼寧、吉林、內蒙古、寧夏、山東、山西、陜西和黑龍江共計14個省。

表2 我國已檢出的牧草種帶真菌Table 2 Seed-borne fungi isolated from forage in China

針對6種重要牧草的種帶病原真菌的致病性在培養皿中進行了初步測定(表3)，共分離得到種帶真菌50個屬，可大致分為3類：1)病原真菌，在一定條件下會嚴重影響種子質量并抑制幼苗生長，如鐮刀菌(Fusariumspp.)、離蠕孢(Bipolarisspp.)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)等[8,28]；2)拮抗菌，通過代謝產物或者競爭作用等方式抵抗病原菌，如枝頂孢(Acremoniumsp.)、球毛殼菌(Chaetomium globosum)等[29-30]；3)貯藏真菌，種子收獲后在貯藏期間傳播的真菌，如曲霉(Aspergillusspp.)和青霉(Penicilliumspp.)等[31-32]。

續表2Table 2 (Continued)

3 影響種帶真菌的因素

3.1 環境條件

由于每種真菌孢子發育、繁殖、侵染和傳播所需的環境條件不同，不同種子種帶真菌的種類和數量均不相同，即使是同一種子，在不同培養條件和不同培養基質上的帶菌情況也會存在差異[33]。李春杰和南志標[8]在研究苜蓿種帶真菌區系時發現，不同產地的各種樣之間其帶菌率存在差異，相同產地的不同品種之間其種子帶菌率也存在很大的差異。濕潤半濕潤地區帶菌率較高，干旱地區帶菌率較低。帶菌率最高可以達到100%，最低僅為0.75%。沙打旺的帶菌率與其成熟、收獲期的氣候條件息息相關，即濕潤度越高，種子帶菌率越高[5]。其中產自淮陰的種子帶菌率最高，為20%；產自保定的種子帶菌率最低，達到4.5%。收獲期的濕潤度與種子帶菌率極顯著正相關(P＜ 0.01)，R2= 0.987。

表3 種帶真菌致病性測定Table 3 Pathogenicity of seed-borne fungi

3.2 貯藏條件

隨著貯藏時間的延長，紫花苜蓿帶菌種子數量下降，主要種帶真菌交鏈孢、曲霉和枝孢的檢出率也隨之下降[31]。室溫條件下貯藏300 d較貯藏60 d的種子真菌檢出率降低了3%。同時，隨著溫度濕度的增高，有利于貯藏真菌的生長發育和繁殖，表現出苜蓿種帶真菌檢出率逐漸增高。室溫條件下種子帶菌率僅為10%；在35 ℃，10%種子含水量的條件下，種子帶菌率達到了29%。老芒麥帶菌率亦是隨著儲藏時間的增加呈下降趨勢[20]。其中，2010年收獲的種子帶菌率為38%，顯著(P＜ 0.05)高于其之前收獲的種樣帶菌率，造成這種現象的原因可能是隨著儲藏時間的增加，不能適應貯藏環境條件的真菌漸漸被淘汰掉，另一方面隨著時間的增加，老芒麥種子的休眠不斷被解除，而真菌侵染速率隨著種子的萌發而降低[20,33]。

3.3 種子部位

真菌在種子的部位直接決定了病害發生的強度[34]。種子的不同部位其種帶真菌的種類與數量亦會不同。有研究表明，種帶腐生真菌多存在于種子表面，種子胚上幾乎不存在[35]。對淮陰沙打旺種樣解剖檢測表明，85.7%的沙打旺種帶真菌存在于子葉內[5]。檢測多年生黑麥草種帶真菌存在部位時發現，黑麥草稃殼上檢出真菌15種，胚乳檢出16種而胚上僅檢出6種[21]。檢測蘇丹草種帶真菌時亦發現，種皮檢出真菌最多，達到13種；穎殼次之，為12種；胚乳檢出10種而胚內檢出真菌最少(7種)[36]。造成這種現象的原因主要為真菌入侵時，種子的形態結構是否能夠對之造成入侵障礙[37]。同時亦與真菌種類及其入侵強度息息相關。

4 種帶病原真菌的防治

南志標[37]提出建立我國牧草病害可持續管理防治體系，即“以信息技術、生物技術和經濟學與社會學的知識為技術支撐，通過抗病品種的利用和對草地的持續管理，并輔以殺菌劑拌種和生物防治等措施，將病害控制在經濟閾值水平之下，達到提高草地農業生態系統整體生產力和穩定性的目的”。目前，我國牧草種帶真菌常見的防治方法有4種。

4.1 熱水處理

熱水處理法具有易于操作，對種子及生態環境影響較小的優點。Nan等[38]檢測柱花草(Stylosanthes guianensias)種子的種帶真菌之后，確認種帶真菌多位于種皮，故選擇了熱水處理進行防治用以替代化學殺菌劑。經過試驗確定將種子于55 ℃的熱水中浸泡10 min防治效果最佳，種子被感染率下降31%。若繼續提高溫度和浸泡時間，可以減少種帶真菌的數量但會造成對種子的不良影響，如發芽率降低，死種子數量的增加。張穎[21]發現，經過45 ℃熱水處理20 min的多年生黑麥草種子可降低其種子帶菌率35%，減少死種率10%，且不影響種子的發芽率。但是使用熱水處理要注意溫度控制在適宜范圍內，因為熱水處理不當會導致發芽率的降低。

4.2 微波處理

研究表明，使用微波處理可以達到安全、高效的滅菌效果，但是要注意處理時間與微波強度的控制，以保證種子活力不受影響[39]。適當強度的微波處理不但能夠降低披堿草種子的帶菌率，而且可以顯著促進其芽的生長及幼苗鮮重和株高的增加[40]。測試發現，在150 W功率下進行40 s的微波處理不但能夠有效降低種子的帶菌率55.83%，且不影響種子的活力，還可以進一步促進幼苗的生長以及生物量的積累，處理后幼苗苗長提高了15.87%，株高提高了10.49%。

4.3 干熱處理

干熱處理在一定處理范圍內不但可以殺菌，而且能夠促進種子萌發與幼苗生長。但是，處理的溫度和時間應控制在種子可以耐受的范圍之內，反之種子的活力會深受影響。研究發現，75 ℃處理20 d能使披堿草種子帶菌率從93.17%顯著降到0(P＜ 0.05)[41]。同時，種子發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數和幼苗鮮重分別顯著提高36.37%、73.94%、50.38%、63.38%和7.79%，且在幼苗生長初期對芽和根的生長有促進作用，處理后芽長、根長分別增加了0.54%和14.43%。

4.4 殺菌劑拌種

殺菌劑拌種是指在播種之前，使藥劑與種子充分攪拌混勻。拌種不但可以起到防病治蟲的效果，而且對種子危害很小，已經廣泛應用于種子的生產活動中。南志標團隊曾系統論述了在牧草病害防治過程中，殺菌劑拌種的應用及其優點[42-43]，并指出殺菌劑拌種是一種有效且經濟的病害防治方式。總體而言，殺菌劑拌種之后種子的發芽率和出苗率可顯著提高，但會因為殺菌劑種類、拌種對象、土壤條件和拌種種子活力的不同，造成拌種之后效果各異[44-45]。針對紫花苜蓿、多年生黑麥草、高羊茅、草地早熟禾(Poa pratensis)和蘇丹草的試驗表明，不同殺菌劑拌種之后，多數殺菌劑可以顯著(P＜ 0.05)提高種子發芽率，促進幼苗生長，提高生物量(表4)。

4.5 其他措施

近年來，一些新興的防治種帶真菌的方法在其他植物的種子上取得了良好的防效，但未在牧草種子上進行相關研究。

臭氧作為一種廣譜殺菌劑在農業生產中應用越發廣泛。臭氧的殺菌作用原理為單原子氧的氧化作用。單原子氧與引起植物病害的各種病原物接觸之后，氧化其組織蛋白，進而使之失去活性甚至死亡。研究發現，2～6 mg·L-1的高濃度臭氧水對高粱(Sorghum bicolor)種子進行處理，種子在2 mg·L-120 min和6 mg·L-110 min處理條件下，發芽霉變率最低，僅為6%[47]。在研究水稻(Oryza sativa)種子滅菌方法時發現，超聲波和臭氧水結合處理水稻種子可以顯著提高殺菌效率，用超聲波結合臭氧水處理3 h后殺菌率可以達到90%[48]。

王玉霞等[49]以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的發酵液為原料，制成生物拌種劑，應用于玉米(Zea mays)種子防治種傳和土傳病害。結果表明，該生物制劑對根腐病的防效超過80%，對黑穗病的防效超過74.6%，對地下害蟲防效超過66.7%，同時可以使玉米增產8.7%～5.7%。但是環境因素會影響生防物質的防效，其穩定性和持續性均會發生變化。黃曦等[50]指出，為實現生防物質互補、多種病害兼防、作用持久的良好防治效果可考慮將生防物質配合化學藥劑使用或者配合使用多種生防物質。

表4 殺菌劑對牧草種帶真菌的防治效果Table 4 Effect of different fungicides on seed-fungi of forage

5 問題與展望

相較于種帶真菌造成的危害，牧草成株后的病害往往更易引起人們的重視，但是種子作為植物生活史的重要階段同時也是植物生活史的薄弱環節，更易受到各種生物或非生物的脅迫影響，因此要更加重視種帶真菌的檢測與防治以減少未來可能發生的病害[51-54]。目前，我國牧草種帶真菌的研究已取得了巨大的進展，但是仍需加強以下幾個方面：1)牧草種帶真菌的檢測大多采用培養方法進行分離純化，在今后的研究中為得到更加全面準確的種帶真菌信息，需進一步結合非培養的分子生物學方法進行研究。2)多數研究表明，種帶病原真菌會對種子帶來嚴重的不利影響，如抑制種子發芽與幼苗生長，降低種子質量。但是造成該影響的具體物質究竟是什么，及其影響種子質量的詳細作用機制尚需進一步進行深入研究。3)有關牧草種帶真菌的防治研究尚不全面，應加大研究力度爭取全面覆蓋所有的重要牧草，以達到科研與生產實踐結合的目的。