荻幼穗誘導不同類型愈傷組織的差異

趙浩雁，劉建秀，陳靜波，李建建，汪 毅，王 凱，宗俊勤

（江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014）

荻(Miscanthus sacchariflorus)屬于禾本科芒屬(Miscanthus)，為多年生C4草本，植株高大[1]，是起源于我國的優良能源植物。其在我國分布區域廣泛，從沿海到內陸山區、從溫帶到熱帶均有分布，可在含鹽0.35%以上、pH 6.5～7.5的土壤中旺盛生長[2]。荻具有投入少、適應強、生物質產量高、燃燒特性好和再生能力強的特點[3]，也是用于植被修復、防沙護坡、改善生態環境等的理想的草本能源植物[4]。此外，還可作為生產上用于土壤改良的生物炭的原料，乃至用于化學工業、制造業和其他產業，如可生物降解建筑材料等[5]。

荻的無性繁殖方式一般有根莖直播法、根莖育苗栽培法、莖稈育苗移栽法等多種方法[6]。荻的有性繁殖多采用種子繁殖，其種子來源廣泛，幼苗根系發達，環境適應性強[7]，但通過種子繁殖的后代背景復雜且生長發育過于緩慢，而由于荻為異花授粉植物，具有禾本科植物中廣泛存在的自交不親和的特性，因此在自然環境下主要還是通過根狀莖進行營養繁殖[8]。荻的根莖繁殖雖然相對于種子繁殖生長發育速度略快，但也僅比種子繁殖面積增加3倍[9]。由此可以看出，采用常規手段對荻進行大規模繁育存在諸多限制。而通過組織培養進行無性繁殖，不僅能提高擴繁效率、保持材料的優良性狀，而且還是進行體細胞篩選和遺傳轉化等遺傳改良的有效手段[7]。

植物再生體系的建立，不僅需要選擇合適的外植體，同時培養基的選擇和所誘導出的愈傷組織的狀態也是能否成功建立再生體系的關鍵因素[10]。芒屬植物愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的形成取決于外植體的類型和發育階段[11]。目前芒屬植物不同外植體誘導愈傷組織的研究已有相關報道，主要以種子[12]、腋芽[13-15]、花藥[16]、幼穗[15,17]、葉片[11]等為外植體進行了再生體系的建立。但Holme和Petersen[11]以葉尖、葉片、根系以及未成熟的花序，研究了不同外植體誘導出愈傷組織再生能力間差異，發現以幼穗為外植體建立再生體系效率最高，而以長度為0.1～2.5 cm幼穗為外植體的愈傷組織誘導率明顯高于長度為2.6～5.0 cm較成熟花序[17]。Chae等[18]在構建荻再生體系時，同樣認為幼穗為外植體的最佳選擇。

現有報道表明，不同的激素組合對荻再生的影響不同，選用紫色、紫褐色愈傷組織構建再生體系最佳，黃綠色愈傷組織次之，其紫褐色愈傷誘導率為59.20%[19]。進一步研究表明，紫褐色愈傷組織形成早，通過進一步繼代得到的淡黃色致密愈傷組織效果最佳，能夠成功分化且分化率可達75.00%[20]。而Katarzyna[21]在構建荻植株再生體系時則發現白色致密愈傷組織分化率最高，該結論與Zhao等[22]報道一致。綜合現有報道表明，幼穗為構建芒屬植物再生體系的最佳選擇，通過幼穗誘導愈傷組織可以獲得不同類型的愈傷組織，然而不同類型愈傷組織的愈傷組織誘導率、分化率、再生率等方面在不同的報道中存在明顯的差異。

本研究以采集自濱海鹽堿地的耐鹽荻資源的幼穗為外植體，以MS為基本培養基，分析不同激素組合對荻愈傷組織誘導、分化、生根的影響，進一步對從荻外植體中誘導出不同狀態愈傷組織之間的差異進行研究，從而建立高效再生體系并明確荻再生體系建立的最佳愈傷組織類型，為構建高效遺傳轉化體系進行荻種質改良提供基礎和必備條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的荻資源材料于2008年采自山東省東營市(37°43′ N, 119°01′ E)的濱海鹽堿地中 (土壤可溶性鹽含量為0.6%)，現種植于江蘇省中國科學院植物研究所草業研究中心試驗基地 (32°02′ N, 118°28′ E)，材料在自然條件下保存和繁殖。

1.2 試驗方法

以荻幼穗為外植體建立其再生體系的方法主要參考YI等[23]，略加改進。

1.2.1 外植體的處理

外植體選取正在生長發育中的幼穗，在試驗地將幼穗取下后立即放入存有冰袋的保溫盒中進行低溫保存帶回實驗室，在佳寶JB-CJ-1FD潔凈工作臺上將幼穗放入1.0%的氯化汞中浸泡2 min后用無菌水沖洗3次，確保洗掉氯化汞殘留，再用75%的酒精浸泡1 min后用無菌水沖洗3次，確保洗掉酒精殘留。將滅菌完畢的幼穗放置在無菌濾紙上，吸干外植體表面水分，并將其剪成2.5 cm的小段后，剝離幼穗外葉鞘和苞葉后備用。

1.2.2 愈傷組織誘導

將剝離的幼穗接入高10.5 cm、底徑6.5 cm、口徑5.5 cm的組培瓶中，每瓶含有30 mL滅完菌的愈傷誘導培養基，培養基為MS + 30.0 g·L-1蔗糖 +0.72 g·L-1脯氨酸 + 1.0～3.0 mg·L-12,4-D + 0.01～0.1 mg·L-16-BA + 3.0 g·L-1植物凝膠，pH 5.8～6.0。接種后材料放置于培養室中進行暗培養，溫度控制在(25 ± 1)℃。每100節幼穗作為一個重復，每個處理3個重復，3 d觀察一次，30 d后統計不同培養基誘導的愈傷組織的數量，并統計最佳愈傷培養基上不同類型愈傷組織的數量。

1.2.3 愈傷組織繼代

待愈傷長到直徑1～1.5 cm時，進行繼代操作。繼代時，用鑷子取出不同類型愈傷組織放至無菌濾紙上，并用鑷子將其解離成0.4～0.5 cm大小的愈傷塊，分別接入高10.5 cm、底徑6.5 cm、口徑5.5 cm的組培瓶中，每瓶含有30 mL滅完菌的繼代培養基，培養基為 MS + 30.0 g·L-1蔗糖 + 1.44 g·L-1脯氨酸 + 3.0 mg·L-12,4-D + 0.1 mg·L-16-BA + 3.0 g·L-1植物凝膠，培養條件與愈傷誘導時相同。每39塊愈傷作為一個重復，每種類型愈傷3個重復，28 d繼代一次，繼代后統計不同類型愈傷的數量。

1.2.4 愈傷組織分化

選取不同類型的愈傷組織接入高10.5 cm、底徑6.5 cm、口徑5.5 cm的組培瓶中，每瓶含有30 mL滅完菌的分化培養基，分化培養基為MS + 30.0 g·L-1蔗糖 + (1.0～4.0) mg·L-16-BA + (0.5～1.0) mg·L-1NAA +7.0 g·L-1瓊脂，pH 5.8，放置于培養室中進行24 h光照培養，光照強度為 100 μmol·(m·s)-1，溫度 為(25 ± 1) ℃。每100個愈傷作為一個重復，每個處理3個重復，5 d觀察一次，30 d后統計不同培養基上不同類型的愈傷能夠分化的愈傷數量。

1.2.5 生根

待分化苗長至3～5 cm高后，將由不同類型愈傷組織分化得到的分化苗分別接入高10.5 cm、底徑6.5 cm、口徑5.5 cm的組培瓶中，每瓶含有30 mL滅完菌的生根培養基，生根培養基為1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA + 7.0 g·L-1瓊脂，pH 5.8～6.0[24]。培養條件與愈傷分化時一樣。每30株分化苗作為一個重復，每種類型愈傷組織分化得到的分化苗3個重復，3 d觀察一次，21 d后統計其生根苗數量。

1.2.6 煉苗與移栽

待無菌苗根長2～3 cm時，可進行煉苗處理。煉苗時，打開培養瓶瓶蓋，加入1 cm高的自來水，放置于培養室中光照培養，溫度控制在(25 ± 1) ℃，每天定時換水。培養3～4 d后，小心取出無菌苗，用自來水洗去附著于無菌苗根部的培養基后，種植于裝有蛭石(將蛭石提前放于100 ℃ 的烘箱中烘干24 h)的穴盆(口徑10 cm、高9.5 cm)中。適當澆水，保持土壤濕潤。放置于賽福PGX-280L型恒溫光照培養箱中培養，培養溫度設置為(25 ± 1) ℃，12 h光照培養，12 h暗培養，每30株作為一個重復，每種類型愈傷組織分化得到的分化苗3個重復，20 d后以植株直立、新葉長出、長勢健壯為成活標準，統計其成活數量。

1.3 數據處理

各個指標具體計算方法如下：愈傷誘導率=產生的愈傷組織數/接種的外植體數 × 100%；愈傷增殖系數 = 繼代后愈傷數/繼代前愈傷數 × 100%；愈傷分化率 = 分化的愈傷數/接種總愈傷數 × 100%；生根率 = 生根分化苗數/接種總分化苗數 × 100%；成活率 = 成活的分化苗數/總移栽分化苗數 × 100%。

以上各項指標的實測值分別按照上述進行計算，用Excel 2000進行數據處理，然后用SPSS 13.0對所有數據進行方差分析，并用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導

以荻的未成熟花序作為外植體，消毒后接種于含有不同濃度的6-BA和2,4-D的MS基礎培養基上，觀察不同激素濃度及配比對其愈傷組織誘導的影響。不同激素組合對荻的愈傷組織的誘導率明顯不同，愈傷組織誘導率最高的培養基為MS +30.0 g·L-1蔗糖 + 0.72 g·L-1脯氨酸+ 3.0 g·L-1植物凝膠+ 3.0 mg·L-12,4-D + 0.1 mg·L-16-BA，其愈傷組織誘導率可達到99.67%(表1)。

通過對最佳愈傷組織誘導培養基上誘導出的愈傷組織觀察發現，所誘導出的愈傷組織大致可分為4類：Ⅰ類愈傷組織呈黃色、顆粒明顯、結構致密。該類愈傷組織誘導率最低，僅有7.01%(圖A1、表2)；Ⅱ類愈傷組織呈白色、顆粒明顯、質地較硬，愈傷組織誘導率為61.92%(圖A2、表2)，是所誘導出的愈傷組織類型中誘導率最高的；Ⅲ類愈傷組織呈紫紅色、質地較為松軟、不明顯顆粒狀，愈傷平均誘導率為21.02%(圖A3、表2)；Ⅳ類愈傷組織呈透明、質地極為松軟、不具顆粒結構，該類愈傷平均誘導率為9.72%(圖A4、表2)。

2.2 愈傷組織繼代

一般情況下，繼代培養基與愈傷誘導培養基基本一致，而本研究繼代培養基參考Christian 等[25]的方法，在愈傷誘導培養基的基礎上將脯氨酸的用量調整至1.44 g·L-1。通過對最佳愈傷誘導培養基所誘導的不同類型的愈傷組織進行繼代后發現，不同類型的愈傷組織增殖系數存在較大的差異(表3)，其中紫紅色愈傷組織的增殖系數是所有類型愈傷組織中最高的，平均可達到299.96%，與白色愈傷組織差異不顯著(P＞ 0.05)，但顯著高于其他兩類愈傷組織(P＜ 0.05)。白色愈傷組織增殖系數略低于紫紅色愈傷組織，平均為270.82%，但顯著高于其他兩類愈傷組織。無色透明愈傷組織和黃色愈傷組織的增殖系數顯著低于上述兩類愈傷組織，分別為199.76%和187.10%。

表1 不同激素組合對愈傷誘導率的影響Table 1 Effects of different hormone combinations on callus induction rate

2.3 愈傷組織分化

圖1 荻幼穗誘導出的不同愈傷組織再生過程Figure 1 Photographs of the tissue culture regeneration process in different types of callus induced from immature inflorescences of Miscanthus sacchariflorus

植物愈傷組織的分化率很大程度上取決于生長調節劑的配比[26]。本研究以MS + 30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂為基礎培養基，通過添加不同濃度的6-BA和NAA(表4)，將不同類型愈傷組織分別接種于不同的愈傷組織分化培養基上并分析其愈傷組織分化情況，以明確不同類型愈傷組織的分化能力及最適宜的分化培養基。第Ⅰ類愈傷組織在不同愈傷組織分化培養基上均有一定的分化率，最適于該類愈傷組織分化的激素組合為2.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA，其分化率高達93.16%，而其他激素組合下的愈傷組織分化率均低于85.00%，當激素組合為 4.0 mg·L-16-BA + 1.0 mg·L-1NAA 時，愈傷組織分化率最低，僅有40.17%。第Ⅱ類愈傷組織在不同激素組合的愈傷分化培養基上的分化情況與第Ⅰ類愈傷組織的分化情況類似，在不同的愈傷組織分化培養基上均有一定的分化率，其最佳分化培養基的激素組合同樣為2.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA，達到 90.60%，而在 4.0 mg·L-16-BA + 1.0 mg·L-1NAA的激素組合時分化率最低，為43.59%，該類愈傷組織最高分化率略低于第Ⅰ類愈傷組織。第Ⅲ類愈傷組織在各個愈傷組織分化培養基上也都具有一定的分化能力，但均明顯低于第Ⅰ類和第Ⅱ類愈傷組織，其愈傷組織的最高分化率僅有29.91%，同時在分化過程中發現該類愈傷組織產生了大量的不定根，說明此類愈傷具有一定的分化能力，但是其愈傷組織狀態并不理想。第Ⅳ類愈傷組織在所有的愈傷分化培養基上的分化率均為0，說明此類愈傷組織沒有分化能力。

表2 最佳愈傷誘導培養基上不同類型愈傷組織的誘導率Table 2 Callus induction rate on optimum callus induction medium

表3 不同類型愈傷組織的增殖系數Table 3 The multiplication coefficient of different type of callus

表4 激素類型和濃度對不同類型愈傷組織分化率的影響Table 4 Effect of hormone and concentration on callus differentiation rate

上述結果表明，4類愈傷組織中除了第Ⅳ類愈傷組織外，其他3類愈傷組織均具有一定的分化能力，也就是說除了第Ⅳ類愈傷組織外，其他3類愈傷組織均為具有分化能力的愈傷組織，而這3類胚性愈傷組織雖然在分化能力上有一定的差異，但是其分化率最高的激素組合均為2.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1NAA，表明此激素組合為荻愈傷組織的最佳分化培養基。

2.4 生根與移栽

將生長至2～3 cm高的叢生芽用鑷子小心分成單株后，接入生根培養基中進行生根培養，由3種類型愈傷組織誘導出的叢生芽在培養7 d后均開始長出健壯的不定根，20 d后生根率均為100%，且在生根速度和數量方面無明顯差異。而后將經過3 d煉苗后的無菌苗小心取出并洗去培養基，移栽于花盆中后放置于25 °C 恒溫光照培養箱中培養20 d，移栽成活率達到100%。

3 討論與結論

本研究選用采自濱海鹽堿地的荻種質資源的幼穗為外植體，通過對誘導出的4種不同類型愈傷組織在愈傷組織誘導、分化、生根和移栽等方面進行比較分析，探究所誘導出不同類型愈傷組織之間的差異，從而充分挖掘所誘導出的不同類型愈傷組織的用途，最大限度的提高荻再生效率，不僅成功構建了一套高效的荻植株再生體系，也為荻優良種質的繁育和遺傳改良奠定了基礎。

選擇最佳的基本培養基是進行愈傷組織培養的一個重要方面，研究表明，MS是進行荻愈傷組織誘導的最佳基本培養基之一[27-29]。因此，本研究也采用了MS培養基作為愈傷組織誘導、繼代、分化的基本培養基。而不同激素組合對荻愈傷組織的誘導率影響不同，在禾本科植物的愈傷組織誘導中，2,4-D通常是起決定作用的植物生長調節劑，2,4-D與6-BA配合使用不僅能夠提高愈傷組織的誘導率，而且對胚性愈傷組織的形成具有明顯的促進作用[27-28,30]?，F有的報道表明，2,4-D和6-BA也是進行荻愈傷組織誘導中最常用的兩種激素[21,31]。在使用荻幼穗作為外植體誘導愈傷組織時添加適量的脯氨酸，可以顯著降低外植體的褐變，減輕培養基的褐化，大大降低褐化對愈傷組織誘導的影響[32]。0.1 mg·L-16-BA是荻誘導愈傷組織時的最佳濃度[30]，因此6-BA含量為0.1 mg·L-1時，本研究通過添加3.0 mg·L-12,4-D獲得了99.67%愈傷組織誘導率，其胚性愈傷組織誘導率也明顯提升，雖然有報道認為，2,4-D濃度的差異對愈傷組織誘導、胚性愈傷組織形成和植株再生無顯著影響[11]，但該結果明顯異于大多數相關報道[17,19-20,33]。

在進行愈傷組織誘導的過程中，一般情況下都會發現所誘導出的愈傷組織的狀態會有所差異，最典型的就是誘導出黃色胚性愈傷組織和透明非胚性愈傷組織。大量的報道發現，在蘆竹(Arundo donax)[34]、金蕎麥(Fagopyrum dibotrys)[35]、毛竹(Phyllostachys edulis)[36]、甘蔗 (Saccharum officinarum)[37]等植物愈傷組織誘導過程中，不僅僅只有上述兩類愈傷組織，還會出現白色、紫紅色、紫褐色、綠色等不同類型的愈傷組織，而這些愈傷組織很多也是具有分化能力的。芒屬植物中同樣存在誘導出不同類型愈傷組織的現象[20,32,38-39]。而本研究中也發現，以荻幼穗為外植體所誘導出的愈傷組織形態各異，大致可以將愈傷組織分為4類：Ⅰ類愈傷組織呈黃色，該類愈傷組織的幾誘導率僅有7.01%；Ⅱ類愈傷組織呈白色，愈傷平均組織誘導率為61.92%，是所誘導出的愈傷組織類型中誘導率最高的。Ⅲ類愈傷組織呈紫紅色，愈傷平均誘導率為21.02%；Ⅳ類愈傷組織，該類愈傷平均誘導率為9.72%。

大量的研究主要集中于不同的激素組合、基本培養基和愈傷組織繼代培養條件對于愈傷組織增殖系數的影響[40-42]，而對荻不同類型愈傷組織增殖系數方面的研究目前還未見報道。而本研究則針對愈傷組織誘導情況，對誘導出的不同類型愈傷組織的繼代增殖情況進行了研究，發現其存在顯著差異，紫紅色愈傷組織和白色愈傷組織的增殖系數極高，分別達299.96%和270.82%，淺紫色愈傷組織增殖能力強已經在現有報道中得到了認同[22,39]。也就是說，在相同基數的情況下，紫紅色愈傷組織和白色愈傷組織更有利于建立荻高效再生體系。

植物生長調節劑對愈傷組織的分化起著決定性的作用[18]。在參考大量芒屬植物再生體系構建的基礎上，本研究中設置了8種不同濃度梯度2,4-D和6-BA的分化培養基組合，結果表明，當6-BA濃度高于3.0 mg·L-1時，對愈傷組織的分化率抑制明顯，這與先前報道高水平的6-BA將會引起愈傷組織褐化[24]的結果基本一致。在結合使用NAA和6-BA誘導愈傷組織分化時，當NAA的濃度高于1.0 mg·L-1時，愈傷組織會迅速長出大量不定根，抑制芽的分化[43-44]，最適合芒屬植物分化的NAA濃度為0.5 mg·L-1[16]。本研究發現，從荻幼穗中誘導出具有分化能力的3類愈傷組織，在不同的激素組合誘導分化時，分化率存在一定差異，但均在激素組合為2.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA時，愈傷組織分化率最高。王子嵐等[32]和王青云等[24]報道的選擇亮黃色、生長良好且質地緊密的愈傷組織轉接到繼代培養基上分化率和生根率均最高。而何立珍等[20]也認為，選用明黃色、顆粒明顯、結構緊密的愈傷組織的愈傷分化率較好，但是其主要通過對誘導率最高的紫色愈傷組織進行調整，促使紫色愈傷組織逐漸轉變為淡黃色更具分化潛力的致密愈傷組織，篩選新形成的淡黃色愈傷組織誘導分化，從而獲得再生植株。本研究也發現，所有愈傷組織中黃色愈傷組織的分化率最高且狀態穩定，雖然該類愈傷組織的增殖系數最低，但在時間允許的情況下進行大量擴繁，可用于進行荻遺傳轉化和種質改良工作。顧振惠等[19]則直接使用紫色、紫褐色愈傷組織構建再生體系，更側重于紫色、紫褐色愈傷組織形成早、分化快的特點，而本研究同樣發現，紫紅色愈傷組織增殖系數最快，可以在短期內獲得大量愈傷組織，雖然其分化率相對較低，但是仍可達到縮短荻再生的周期并快速獲得再生植株的目的。而本研究中得到數目最多的白色愈傷組織則尚未有人進行深入研究，本研究認為，白色愈傷組織也是胚性愈傷組織，在繼代和分化后，雖然分化率略低于黃色愈傷組織，但是其分化率仍大于90.00%，該類愈傷組織狀態穩定，誘導率高，增殖系數明顯高于現有報道最多的黃色愈傷組織，采用該類愈傷組織所構建的再生體系，不僅可以作為優良種質大量繁育的首選愈傷組織類型，而且也是進行荻遺傳轉化和種質改良工作的最佳愈傷類型。

本研究以荻幼穗為外植體，最佳愈傷組織誘導培養基為 MS + 30.0 g·L-1蔗糖+ 0.72 g·L-1脯氨酸+3.0 mg·L-12,4-D + 0.1 mg·L-16-BA + 3.0 g·L-1植物凝膠，可誘導出4種類型的愈傷，分別為黃色愈傷、白色愈傷、紫紅色愈傷、透明水漬狀愈傷，4種愈傷的誘導率分別為7.01%、61.92%、21.02%和9.72%，愈傷總誘導率為99.67%；最佳分化培養基為MS +30.0 g·L-1蔗糖+2.0 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA +7.0 g·L-1瓊脂，其中黃色愈傷、白色愈傷和紫紅色愈傷均為胚性愈傷組織，其分化率分別為93.16%、90.60%和29.9 1%；采用1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA +7.0 g·L-1瓊脂作為生根培養基時，3種胚性愈傷組織所分化的再生植株的生根率均達到100%；將再生植株經過煉苗后，移栽于以消毒蛭石為基質的小花盆中，20 d后所有移栽苗全部成活。

不同類型的愈傷組織的誘導率、增殖系數、分化率等方面均差異明顯。黃色愈傷組織的分化率最高且狀態穩定，雖然該類愈傷組織的增殖系數最低，但在時間允許的情況下進行大量擴繁，可用于進行荻遺傳轉化和種質改良工作；紫紅色愈傷組織形成早、分化快、增殖系數最快，可以在短期內獲得大量愈傷組織，縮短荻再生的周期并快速得到再生植株；白色愈傷組織誘導率高，增殖系數明顯高于黃色愈傷，不僅可以作為優良種質大量繁育的首選愈傷組織類型，而且也是進行荻遺傳轉化和種質改良工作的最佳愈傷類型。