胎兒染色體非整倍體無創檢測在高危孕婦產前診斷中的應用

郭彩茹 亓民 牛宇杰 王琛琛

胎兒染色體非整倍體無創檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)通過采集孕婦外周血，提取總游離DNA，采用新一代高通量測序技術，結合生物學信息分析，計算出胎兒游離 DNA(cell-freefetal DNA，cffDNA)相對含量，得出胎兒染色體異常的風險率。由于不需要進行創傷性取樣，具有高敏感性和高特異性，已越來越受到臨床的重視[1]，它能使胎兒21-三體綜合征檢出率達到 99%[2-3]，作為一種新的、近似于診斷水平[4]的篩查胎兒染色體非整倍體技術應用于臨床。本文通過對在本院接受NIPT 的697例高危孕婦的檢查結果進行回顧性分析，以探討NIPT在診斷高危孕婦胎兒染色體非整倍體疾病中的臨床應用價值。

資料與方法

1. 一般資料：選擇2014年5月—2017年7月，在本院產科門診確定為高危孕婦697例，孕婦年齡19～45歲，平均年齡(33.0±5.3)歲。高危因素為高齡孕婦(預產期年齡>35歲)355例占50.9%、唐氏綜合征血清學篩查高風險225例占32.3%、唐氏綜合征血清學篩查臨界風險86例占12.3%，既往有不良孕產史31例占4.4%。孕周 12～28 周，均為單胎，進行NIPT。唐氏綜合征高風險值≥1/270，臨界風險1/270～1/1000，低風險<1/1000。18-三體綜合征高風險值≥1/350，臨界風險1/350～1/1000，低風險<1/1000。采用統一知情同意書，充分告知孕婦 NIPT 的臨床適應征、檢測范圍、局限性及可能存在的風險[5]，由孕婦自愿選擇并簽署知情同意書。

2. 方法：(1)孕婦外周血胎兒游離DNA檢測。采集孕婦外周血10 ml于Streck采血管中，由廣州達安臨床檢驗中心按SOP 文件使用DNA提取試劑盒(達安基因)提取血漿中游離DNA，利用文庫構建試劑盒(達安基因)構建DNA文庫，將構建好的文庫樣品通過熒光定量PCR儀進行文庫定量。利用第2代測序儀DA8600進行上樣和測序。將測序結果進行生物信息學分析，得出胎兒發生染色體非整倍體疾病的風險率。(2)結果驗證及隨訪。對NIPT結果為高風險者，由鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心，進行B超引導下羊膜腔穿刺術，抽取羊水20 ml，經實驗室培養后，常規制備染色體經G顯帶后染色體核型分析。對NIPT結果為低風險的孕婦隨訪妊娠結局及胎兒出生后的情況。

3.統計學分析：采用 SPSS 17.0 進行統計分析。計數資料用百分數(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1. 孕婦NIPT結果：高危孕婦共 697例，NIPT結果為非染色體整倍體疾病高風險者共 12例：21-三體綜合征 7例，18-三體綜合征 4例，13-三體綜合征 1例。其中高齡組355例，檢出21三體綜合征3例(0.8%)，18三體綜合征2例(0.6%)，13三體綜合征1例(0.3%)，共檢出高風險者6例(1.7%)；唐氏綜合征血清學篩查高危組225例，檢出21三體綜合征4例(1.8%)，18三體綜合征1例(0.4%)，共檢出高風險者5例(2.2%)。唐氏綜合征血清學篩查臨界組86例，檢出18三體1例(1.2%)，不良孕產史組未檢出高風險患者。見表 1。

2. 孕婦NIPT檢測結果與羊水染色體核型分析結果比較：對于12例無創檢測結果高風險者，均進行了羊水染色體核型分析。經分析，NIPT技術對于胎兒非整倍體染色體疾病與羊水穿刺染色體核型分析技術陽性符合率為100%。見表 2。陽性患者均終止妊娠，NIPT結果低風險者685例，經隨訪，截至 2018 年6月31日新生兒均已出生，家屬自述均正常。

3.高齡組孕婦年齡與染色體非整倍體疾病的關系：參與研究的高齡孕婦共355例，其中孕婦年齡35～39歲，292(82.3%)例，胎兒染色體非整倍體疾病發生率為1.0%(3/292)；孕婦年齡>40歲，63(17.7%)例，胎兒染色體非整倍體疾病發生率為6.3%(4/63)；(見表3)。孕婦年齡>40歲，胎兒染色體疾病發病率高于35～39歲組(χ2=7.593，P=0.06)。

表1 高危孕婦NIPT結果分析[n(%)]

表2 NIPT高風險與羊水細胞染色體核型分析結果比較

表3 孕婦年齡與染色體疾病發生率的關系[n(%)]

注：與年齡35～39歲組比較，P=0.06

討論

隨著我國二胎政策的放開，高齡孕婦和唐氏篩查高風險人數不斷增加，如何采取更有效的方法來提高染色體非整倍體疾病的檢出率并減少不必要的有創操作是目前臨床上急需解決的問題。傳統的產前診斷技術，包括絨毛穿刺、羊水穿刺、臍血穿刺，具有染色體核型分析高準確率的優點，且能分析出除了染色體數目異常外的結構異常，為產前診斷的臨床金標準[6]，但是取樣時卻存在0.5%～2%的流產風險，容易導致胎膜早破、絨毛羊膜炎、陰道出血、早產等并發癥。而無創產前檢測具有高準確性、無創傷性等優點且有效降低了侵入性操作引起的流產、感染等風險，易被孕婦接受，同時其適用于孕 12～26周，克服了傳統產前診斷技術在取材以及檢測時間等方面的缺陷和限制，可廣泛應用于臨床。

對本資料提供的697 例唐氏高危孕婦進行NIPT，并對高危患者進行胎兒羊水染色體核型分析。結果表明孕婦外周血游離胎兒 DNA 檢測技術與羊水染色體核型分析的陽性符合率為100%，本文NIPT對唐氏綜合征檢出率高于報道的99%[3,6-7]，未出現假陽性、假陰性可能是因為樣本數量有限，需要進一步積累樣本。胎兒13-三體綜合征的發病率低，約為 1∶25000[8]，本研究13-三體綜合征檢出1例。說明無創DNA 檢測技術可以作為傳統產前診斷技術的有效輔助手段[9]。但對于非整倍體和染色體結構異常的確診仍需通過羊水或臍帶血進行染色體核型分析。

孕婦年齡35～39歲胎兒染色體非整倍體疾病發病率為1.0%(3/292)，孕婦年齡>40歲胎兒染色體非整倍體疾病發病率升高到6.3%(4/63)。結果與先前的研究結果一致[10]。近幾年隨著生育年齡的推遲和二胎政策的放開，因年齡因素直接做產前診斷的孕婦逐漸增多。傳統的羊膜腔穿刺會有0.5%～1%的流產風險，這對于高齡孕婦也是一個顧慮。近年來新發展的孕婦外周血游離DNA高通量測序技術，已被臨床研究證實在檢測染色體非整倍體疾病方面的敏感度和特異度與傳統的核型分析技術有較高的一致性[11]，這種無創DNA產前檢測作為傳統細胞遺傳學的補充，可以解決目前產前診斷技術力量不足的問題，也將會是以后產前篩查和診斷體系的發展方向。