中國被毛孢高產(chǎn)孢菌株的篩選

王錦鋒, 王 忠, 吳鴻雪

(安發(fā)福建生物科技有限公司/福建省天然生物活性物質(zhì)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 寧德 352000)

冬蟲夏草(Cordycepssinensis)是我國傳統(tǒng)的名貴珍惜藥材，與人參、鹿茸并稱為我國三大補(bǔ)品，是由冬蟲夏草菌[Ophiocordycepssinensis(Berk)]侵染蝙蝠蛾幼蟲而形成的蟲菌復(fù)合體，在我國有著悠久的藥食用歷史[1-3]。1989年劉錫琎等[4]首次報(bào)道了中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，2005年被認(rèn)定為冬蟲夏草無性型[5-8]。目前中國被毛孢的相關(guān)研究主要集中在培養(yǎng)、培養(yǎng)基篩選、發(fā)酵工藝以及化學(xué)成分等方面，而關(guān)于不同產(chǎn)地或近似種之間的比較篩選以及優(yōu)良菌株篩選的研究尚少[9-14]。利用中國被毛孢進(jìn)行生產(chǎn)的國內(nèi)企業(yè)僅中美華東制藥等少數(shù)幾家[15-16]。隨著市場對冬蟲夏草需求量的擴(kuò)大，研究和發(fā)掘優(yōu)良的中國被毛孢菌株，對中國被毛孢產(chǎn)業(yè)后期的基礎(chǔ)研究和開發(fā)生產(chǎn)具有重要意義[17]。本研究采用不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法對5株中國被毛孢菌株進(jìn)行了比較，主要考察產(chǎn)孢量，并結(jié)合考慮菌絲生長速度、菌落平均半徑、菌落形態(tài)及菌絲生物量等性狀表現(xiàn)，以期篩選出產(chǎn)孢量高、生物性狀良好的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 5個供試菌株編號為：620-1、620-2、7B、8B和530，均由安發(fā)(福建)生物科技有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)固體培養(yǎng)基，采用試管和平板進(jìn)行培養(yǎng)。①常規(guī)PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，定容至1 000 mL。②加富PDA培養(yǎng)基：即在常規(guī)PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加酵母粉10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.25 g，定容至1 000 mL。(2)液體培養(yǎng)基，采用三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，純牛奶200 mL(或奶粉20 g)，超純水定容至1 000 mL。葡萄糖、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和NaCl均為分析純，奶粉為市售包裝低脂奶粉。

1.1.3 儀器 SPX-250BSH生化培養(yǎng)箱(新苗有限公司)；BSD-YX-2400搖床培養(yǎng)箱(上海精宏科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XW-80A微型漩渦儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)。其他儀器為一般常規(guī)儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將5株中國被毛孢菌株用常規(guī)PDA培養(yǎng)基活化后，分別轉(zhuǎn)接至裝有常規(guī)PDA培養(yǎng)基和加富PDA培養(yǎng)基的試管中，置于16 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 固體培養(yǎng) (1)菌絲生長速度測量和菌落形態(tài)觀察。使用打孔器取邊緣長勢一致的菌塊，分別接種至裝有常規(guī)PDA和加富PDA的平板培養(yǎng)基中央，然后置于16 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。采用三角法(即由中心點(diǎn)向外畫3條線，每2條線之間的夾角為120°)測量菌落平均半徑。每7天觀察1次菌落形態(tài)，并測定菌絲平均生長速度。每個處理重復(fù)3次。(2)菌絲干重測量。將待測菌絲(試管和平板)放入熱水中，使培養(yǎng)基受熱溶解后取出菌落(菌絲)放入培養(yǎng)皿中，置于恒溫干燥箱中烘干至恒重，之后進(jìn)行稱量。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 液體培養(yǎng) 使用打孔器取邊緣長勢相同的菌塊，接種至裝有100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，每瓶接種4粒，置于16 ℃、120 r·min-1的震蕩培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。3次重復(fù)。

1.2.4 分生孢子收集及計(jì)數(shù) (1)固體培養(yǎng)。吸取0.5 mL·L-1的吐溫80溶液10 mL注入待測試管中，使用漩渦儀進(jìn)行充分震蕩。取混合液，使用中速濾紙進(jìn)行過濾。(2)液體培養(yǎng)。使用移液槍直接吸取菌液進(jìn)行過濾。將收集的分生孢子液稀釋后，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算分生孢子數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長速度的比較

供試菌株在平板培養(yǎng)基上從復(fù)蘇至生長90 d的日均生長速度見圖1。由圖1可看出，菌株在加富PDA培養(yǎng)基上的生長速度均高于常規(guī)PDA培養(yǎng)基。在常規(guī)PDA培養(yǎng)基中，除了菌株8B外，各菌株無顯著差異(P>0.05)，菌株8B與其他4個菌株之間均存在顯著差異(P<0.05)；在加富PDA培養(yǎng)基中，菌株620-1生長速度最快、7B最慢，菌株620-1、620-2和530之間無顯著差異，菌株7B和8B也無顯著差異，但菌株620-1、620-2和530與7B、8B之間則存在顯著差異。綜上來看，菌株620-1、620-2和530的生長速度優(yōu)于菌株7B、8B。

供試菌株在平板培養(yǎng)基上菌絲生長前期(0～45 d)、后期(46～90 d)的生長速度變化見表1。由表1可見，各菌株前期生長速度均大于后期，這種現(xiàn)象符合菌絲生長特性，其中620-1最明顯。而菌株7B、8B前后期生長速度幾乎無變化，說明其生長速度不會隨著營養(yǎng)的減少而改變。

2.2 菌落形態(tài)與半徑比較

2.2.1 菌落形態(tài) 5個菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)140 d的菌落形態(tài)見圖2，生長性狀表現(xiàn)見表2。(1)加富PDA培養(yǎng)基上生長的菌落均比較規(guī)則，呈圓形；菌絲呈白色或些許淡黃色。其中，菌株620-1和620-2在培養(yǎng)后期菌落邊緣有一圈土黃色菌絲，但前期并沒有，可能由于后期老化而導(dǎo)致。菌株7B、8B的菌絲較濃密，620-1、620-2和530則較稀疏。(2)常規(guī)PDA培養(yǎng)基上生長的菌落較不規(guī)則，其中菌株620-1、620-2和530菌絲白色、較稀疏，而菌株7B、8B菌絲白色或棕黃色，較濃密；除530外，其他菌株外沿和底部均出現(xiàn)“黑化”現(xiàn)象，可能由于菌絲在生長過程中分泌了某些類似“黑色素”類的物質(zhì)而造成，這一點(diǎn)在液體培養(yǎng)過程中也存在。

A.常規(guī)PDA培養(yǎng)基;B.加富PDA培養(yǎng)基。圖2 中國被毛孢菌株在平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Figure 2 Colony morphology of H.sinensis strains on flat culture media

菌株性狀常規(guī)PDA培養(yǎng)基加富PDA培養(yǎng)基620-1菌絲較疏,白色或灰白色,絨毛狀,菌落較規(guī)則菌絲較疏,白色或灰白色,絨毛狀,菌落規(guī)則620-2菌絲較疏,白色或灰白色,絨毛狀,菌落較規(guī)則菌絲較疏,白色或灰白色,絨毛狀,菌落規(guī)則7B菌絲濃密,白色或棕黃色,絨毛狀,菌落不規(guī)則菌絲濃密,白色或棕黃色,絨毛狀,菌落較規(guī)則8B菌絲濃密,白色或棕黃色,絨毛狀,菌落不規(guī)則菌絲濃密,白色或棕黃色,絨毛狀,菌落較規(guī)則530菌絲稀疏,白色,絨毛狀,菌落規(guī)則菌絲較疏,白色,絨毛狀,菌落規(guī)則

2.2.2 菌落半徑 在培養(yǎng)第140天測量菌落半徑(圖3)。(1)常規(guī)PDA培養(yǎng)基。菌株530菌落半徑最大，620-1次之，但兩者之間無顯著差異，菌株620-2、7B和8B之間也無顯著差異，但與菌株530之間則存在極顯著差異(P<0.01)。總體上，各菌株在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上生長較平均，差異不明顯。(2)加富PDA培養(yǎng)基。菌株530菌落半徑最大，菌株7B最小，兩者之間存在極顯著差異，菌株7B與菌株620-2、8B間無顯著差異。綜上來看，各菌株在2種培養(yǎng)基上的生長趨勢大致相同，但在加富PDA培養(yǎng)基上的菌落明顯大于常規(guī)PDA培養(yǎng)基。其原因?yàn)榧痈慌囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)比常規(guī)培養(yǎng)基高，為菌絲生長提供了更加充分的養(yǎng)分。因此，菌落大小表現(xiàn)為：530>620-1>620-2>8B>7B。

相同培養(yǎng)基附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。圖3 中國被毛孢菌株在平板培養(yǎng)基上的菌落半徑比較Figure 3 Colony radius comparison of H.sinensis strains on flat culture media

2.3 菌絲生物量分析

對供試菌株進(jìn)行2種培養(yǎng)基試管和平板培養(yǎng)，140 d后測定菌絲干重。

2.3.1 試管培養(yǎng) 5個菌株試管培養(yǎng)的菌絲干重見圖4。(1)常規(guī)PDA培養(yǎng)基。各菌株菌絲干重在0.105～0.148 g之間，其中菌株620-1最大(0.148 g)、8B最小(0.105 g)。菌株8B與菌株7B、620-1、620-2之間存在極顯著差異，但菌株530、7B、620-1、620-2之間無顯著差異，說明各菌株在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上生長較為平均，這可能與培養(yǎng)基本身有關(guān)系。(2)加富PDA培養(yǎng)基。各菌株菌絲干重在0.244～0.311 g之間，菌株530最大(0.311 g)、8B最小(0.244 g)，菌株530、7B與620-1、620-2和8B之間存在極顯著差異(P<0.01)。總體上，各菌株在2種培養(yǎng)基上的生長情況較為平均；從菌絲生物量來看，常規(guī)PDA培養(yǎng)基表現(xiàn)為：620-1>620-2>7B>530>8B，加富PDA培養(yǎng)基表現(xiàn)為：530>7B>620-2>620-1>8B。

相同培養(yǎng)基附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。圖4 中國被毛孢菌株在試管固體培養(yǎng)基中的菌絲干重比較Figure 4 Dry weight comparison of mycelia of H.sinensis strains on solid culture media in test tubes

2.3.2 平板培養(yǎng) (1)常規(guī)PDA培養(yǎng)基。各菌株菌絲生物量在0.117～0.256 g之間，其中菌株530最大(0.256 g)、7B最小(0.117g)(圖5)。菌株7B與其他菌株之間均存在極顯著差異，而菌株620-1、620-2和8B之間無顯著差異。說明各菌株在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上生長較為平均，這與試管培養(yǎng)情況相似。(2)加富PDA培養(yǎng)基。各菌株菌絲生物量在0.200～0.488 g之間，菌株620-1最大(0.488 g)、7B最小(0.200 g)，兩者間存在極顯著差異。菌株7B與620-2和530之間存在極顯著差異，與8B之間無顯著差異；菌株8B與7B表現(xiàn)相似。從菌絲生物量來看，常規(guī)PDA培養(yǎng)基表現(xiàn)為：530>8B>620-2>620-1>7B，加富PDA培養(yǎng)基表現(xiàn)為：620-1>620-2>530>8B>7B。

相同培養(yǎng)基附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。圖5 中國被毛孢菌株在平板固體培養(yǎng)基中的菌絲干重比較Figure 5 Dry weight comparison of mycelia of H.sinensis strains on solid culture media on culture plates

綜上所述，就菌絲生物量來看，菌株620-1、620-2和530要優(yōu)于菌株7B和8B。這結(jié)果與菌絲平均生長速度相一致。

2.4 產(chǎn)孢量分析

供試菌株在2種固體培養(yǎng)基以及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)120 d后，收集分生孢子并計(jì)數(shù)。各培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量見表3。

表3 中國被毛孢菌株在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量1)Table 3 Average sporulation capacity of H.sinensis strains on different culture media

1)同列數(shù)值后附不同大寫字母者表示差異達(dá)0.01顯著水平。

2.4.1 固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng) (1)常規(guī)PDA培養(yǎng)基。菌株8B產(chǎn)孢量最高(2.513 5×109個·g-1)，620-1產(chǎn)孢量最低(0.559 3×109個·g-1)，兩者之間存在極顯著差異；而菌株620-1、620-2和530之間無極顯著差異。(2)加富PDA培養(yǎng)基。菌株8B產(chǎn)孢量最高(0.665 2×109個·g-1)，620-2最低(0.165 4×109個·g-1)。菌株620-2與各菌株之間均存在極顯著差異。此外，除菌株620-1外，其他4個菌株在平板常規(guī)PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量高于平板加富PDA培養(yǎng)基。總體上，平板常規(guī)PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢量表現(xiàn)為：8B>7B>530>620-2>620-1；平板加富PDA培養(yǎng)基表現(xiàn)為：8B>620-1>530>7B>620-2。

2.4.2 固體培養(yǎng)基試管培養(yǎng) (1)常規(guī)PDA培養(yǎng)基。菌株7B產(chǎn)孢量最高(4.142×109個·g-1)，620-1產(chǎn)孢量最低(1.133×109個·g-1)，兩者之間存在極顯著差異；而菌株620-1與620-2之間無極顯著差異，但與7B和8B之間均存在極顯著差異。(2)加富PDA培養(yǎng)基。菌株530產(chǎn)孢量最高(0.536 4×109個·g-1)，7B最低(0.244 0×109個·g-1)。菌株7B與530之間存在極顯著差異。此外，菌株在試管常規(guī)PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量高于試管加富PDA培養(yǎng)基。總體上，試管常規(guī)PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢量表現(xiàn)為：7B>8B>530>620-2>620-1；試管加富PDA培養(yǎng)基表現(xiàn)為：530>620-2>620-1>8B>7B。

2.4.3 液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 菌株8B產(chǎn)孢量最高(79.10×106個·g-1)，620-1產(chǎn)孢量最低(8.40×106個·g-1)，兩者之間存在極顯著差異；而菌株620-2和530之間無極顯著差異，但與7B、8B存在極顯著差異。總體上，液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量表現(xiàn)為：8B>7B>530>620-2>620-1。

3 小結(jié)

本研究中，菌塊在培養(yǎng)中出現(xiàn)兩方面的生長，一是在培養(yǎng)過程中菌塊自身在“長大”，即接進(jìn)去的菌塊本身在膨大，且呈“瘤狀”，這現(xiàn)象在其他菌中不常見；二是向外“擴(kuò)散”，并伴隨著絨毛狀菌絲生長(氣生菌絲)。菌株620-1、620-2和530在前期培養(yǎng)中主要表現(xiàn)在菌落的生長上，而未見絨毛狀菌絲生長，菌落生長到一定程度后氣生菌絲才開始生長；7B和8B則從一開始就有絨毛狀菌絲生長，因此在菌落生長上比另外3個菌株要差。

綜合菌絲生長速度、菌落平均半徑、菌落形態(tài)及菌絲干重來看，菌株620-1、620-2和530優(yōu)于菌株7B和8B；但從產(chǎn)孢量來看，菌株7B和8B優(yōu)于另外3個菌株。本研究以篩選高產(chǎn)孢的優(yōu)良菌株為目的，產(chǎn)孢量是最主要的考慮因素。在生物學(xué)性狀表現(xiàn)差異不大的情況下，菌株7B和8B可作為后續(xù)感染蝙蝠蛾幼蟲提供分生孢子的優(yōu)良菌株。