提取劑和酶處理對龍眼可溶性糖提取的影響

安 寧, 張桂彬, 李明偉, 陳秀萍, 胡文舜,, 陳發興

(1.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建省農業科學院果樹研究所，福建 福州 350013)

龍眼是我國亞熱帶名優果樹，果實營養豐富，富含糖、有機酸和Vc，被視為珍貴補品[1]。糖是果實品質和風味物質的主要成分，是氨基酸、維生素、色素和芳香物質等營養成分的合成物質，糖的含量、種類及組成比例是決定果實品質的重要因子[2]。成熟的龍眼果實主要包括蔗糖、果糖和葡萄糖3種可溶性糖[3]。根據單糖與雙糖的比例可將龍眼分為：蔗糖積累型、還原糖積累型和中間類型[4]。

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)是目前最常用的糖成分測定方法，操作簡便且效果理想[5-6]。HPLC測定前通常以水和乙醇溶液做可溶性糖提取劑[7]。由于植物體內存在水解酶，需要采用適當的方法破壞或抑制酶活[8]，微波能快速使酶鈍化失活，滅酶效果較好[9]。當前龍眼果實可溶性糖的提取多采用水提法[10]或乙醇法[4,11]，但不同提取劑的比較及果肉殺酶與否對提取率的影響尚未見報道，在蘋果、桃、荔枝、葡萄等其他果樹上也鮮見相關報道。本研究以乙醇溶液和水為提取劑分別對龍眼果肉進行殺酶與不殺酶處理，比較不同提取方法下的蔗糖、葡萄糖、果糖及總糖含量變化，分析不同提取劑和殺酶與否對提取龍眼果實可溶性糖的影響，以確定龍眼果實可溶性糖的最適提取方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為‘四季龍眼’，2019年1月中旬采自國家果樹種質(福州)龍眼圃。從不同龍眼樹上隨機選擇成熟度基本一致、大小均勻、無機械損傷和病蟲害侵染的果實，混合均勻。

1.2 標準曲線的建立

分別將色譜純級的固體標準品(蔗糖、葡萄糖和果糖)配置成不同濃度的標準溶液。蔗糖質量濃度梯度為5、15、25、35、45 mg·mL-1，葡萄糖和果糖均為1、3、5、7、9 mg·mL-1。經0.45 μm微孔濾膜過濾，用HPLC測定，以峰面積對質量濃度制作標準曲線。

1.3 提取方法

試驗設置殺酶—乙醇法、不殺酶—乙醇法、殺酶—水提法和不殺酶—水提法共4個處理，每個處理4次重復。取約50 g‘四季龍眼’果肉，混勻后隨機平均分為2份，一份進行殺酶，一份不殺酶。殺酶方法參照王紹林[9]和帥良等[10]方法并加以改良，即將果肉放入微波爐中火處理30 s。2份樣品經液氮研磨后，各準確稱取8份2.00 g。

1.3.1 乙醇提取 參照陳秀萍等[12]方法，并加以改良。加7.00 mL體積分數為85%乙醇于37 ℃水浴提取20 min，13 500 r·min-1離心10 min，倒出上清液，提取3次(后2次均加6 mL 85%乙醇)，合并上清液，于65 ℃烘箱濃縮約40 h，用超純水溶解，定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.2 水提取 加7.00 mL 超純水于37 ℃水浴提取20 min，13 500 r·min-1離心10 min，倒出上清液，定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.4 檢測與分析

用高效液相色譜儀(Waters e2695, USA)測定可溶性糖含量。色譜柱為Waters的Sugar-PakTMⅠ柱，流動相為脫氣后的超純水，每次進樣10 μL，流速為 0.4 mL·min-1，柱溫為65 ℃。Waters 2414示差檢測器檢測洗脫峰。EmpowerTM3軟件控制系統運行與處理色譜結果。總糖以蔗糖、葡萄糖和果糖之和計。

采用Excel 2010軟件處理數據，SPSS統計軟件進行顯著性檢驗和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

標樣中各組分的出峰順序依次為：蔗糖、葡萄糖和果糖，其出峰時間分別為9.919、12.273、14.656 min，所有組分在30 min內完成出峰。對測得的數值進行相關分析和線性回歸分析(圖1)表明，相關系數分別為0.998 8、0.993 6、0.999 1，說明蔗糖、葡萄糖和果糖在線性范圍內(分別為5～45、1～9、1～9 mg·mL-1)均保持很好的線性關系。

圖1 蔗糖、葡萄糖和果糖的標準曲線Figure 1 Standard curve of sucrose, glucose and fructose

2.2 提取方法對龍眼可溶性糖提取量的影響

從測得的可溶性糖組分含量(表1)可以看出，4種方法的龍眼果肉糖分提取量存在差異。3種糖分和總糖提取量由高至低均為：殺酶—乙醇法>不殺酶—乙醇法>殺酶—水提法>不殺酶—水提法。殺酶—乙醇法和不殺酶—水提法在蔗糖、葡萄糖、果糖提取量上分別相差40.70、7.56、5.49 mg·g-1，在總糖提取量上相差53.75 mg·g-1。由方差分析可知，除了水作為提取劑時殺酶與否對葡萄糖和果糖提取量差異不顯著，乙醇作為提取劑時殺酶與否對葡萄糖提取量差異顯著(P<0.05)，其余兩兩之間差異均達極顯著水平(P<0.01)。

表1 4種方法龍眼果實可溶性糖提取量的差異1)Table 1 Difference in soluble sugar contents of longan fruits extracted by four extraction methods mg·g-1

1)同列數值后附不同大小寫字母者分別表示差異達0.01、0.05顯著水平。

2.3 提取劑對龍眼可溶性糖提取量的影響

由表1可知，殺酶時用乙醇提取的蔗糖、葡萄糖、果糖含量分別是用水提取的1.27、1.44、1.26倍，分別相差28.94、6.79、4.89 mg·g-1，總糖相差40.62 mg·g-1，均表現為極顯著差異；不殺酶時用乙醇提取的蔗糖、葡萄糖、果糖含量分別是用水提取的1.34、1.43、1.12倍，分別相差32.36、6.37、2.28 mg·g-1，總糖相差41.00 mg·g-1，均表現為極顯著差異。由上可見，在相同條件下用乙醇提取糖的總體效果是水的1.31倍，表明85%乙醇溶液的可溶性糖提取率顯著比水好。

2.4 酶處理對龍眼可溶性糖提取量的影響

由表1可知，醇提條件下，殺酶后蔗糖、葡萄糖、果糖提取量分別是不殺酶的1.07、1.06、1.15倍，分別相差8.35、1.19、3.21 mg·g-1，總糖相差12.75 mg·g-1，差異達顯著或極顯著水平；水提條件下，殺酶后蔗糖、葡萄糖、果糖提取量分別是不殺酶的1.12、1.05、1.03倍，總糖相差13.13 mg·g-1，蔗糖、總糖提取量上表現為極顯著差異，在葡萄糖和果糖上兩者相差均不到1 mg·g-1，差異不顯著。由上可見，在相同條件下殺酶后提取糖的總體效果是不殺酶的1.08倍，表明先進行殺酶更能充分提取可溶性糖。

3 討論與結論

3.1 品種特性

本研究表明，不同提取方法對龍眼果實可溶性糖含量的測定具有明顯影響，乙醇法提取率比水提法高，且提取前先對果肉進行殺酶能更充分提取糖。4種處理中‘四季龍眼’蔗糖與總糖比例均接近75%，比一般的龍眼品種比例高很多。陳秀萍等[3]報道，63份龍眼種質資源果實中蔗糖占總糖含量的42.8%～81.4%，平均為62.5%，以‘四季龍眼’比值最高。該結果與本研究基本一致，體現了‘四季龍眼’的品種特征。本試驗所測定的‘四季龍眼’蔗糖與總糖比例略低于陳秀萍等[3]的報道，可能由于摘取果實季節不同而導致。

3.2 機理分析

3.2.1 提取劑 龍眼果實的糖代謝主要受蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、酸性轉化酶和中性轉化酶的調控和影響[13]。糖分積累是在這些酶的綜合作用下進行的，同時伴隨著呼吸消耗。乙醇法比水提法的糖提取率更高可能是由于與水相比，乙醇作為有機溶劑能降低多數酶的催化活性。在有機溶劑中，酶與底物接觸會受到擴散限制和立體障礙的影響，或者酶分子的動態結構和構象發生改變，從而影響酶的催化活性[14]。如王悅等[15]發現，當乙醇濃度超過22% 時，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶出現活力抑制；張佳佳等[16]發現，隨著乙醇濃度的增加，乙酰膽堿酯酶活力呈不同程度的減小，這些研究均表明乙醇能抑制酶的活性。

3.2.2 酶處理 對果肉進行殺酶處理更能充分提取糖。顏思語等[17]以蘋果、橙子、梨為材料，發現微波加熱能提高3種水果的可溶性糖含量，這與本試驗結果相一致?？赡苡捎跉⒚柑幚砥茐牧斯饨M織和細胞，有助于提取可溶性糖；也可能由于果肉在研磨過程中造成機械損傷，會導致呼吸強度的增加[18]，從而消耗更多的有機物，導致糖分減少，若在果肉研磨之前進行殺酶處理，則能快速抑制果肉細胞呼吸作用而降低糖分的消耗。因此，無論提取劑是乙醇溶液還是水，殺酶處理都能提高糖的提取率，對這兩種方法起到優化作用。此外，水作為提取劑時殺酶與否在葡萄糖和果糖含量上差異不顯著，這可能由于水提取的糖含量低，而所用材料的葡萄糖和果糖含量本身也比較低，導致其在殺酶與不殺酶處理上差別不大。

綜上所述，龍眼果實可溶性糖提取量的高低主要取決于有無充分抑制酶的活性。殺酶—乙醇法中殺酶處理和乙醇雙重抑制酶的活性，糖提取量最高；而不殺酶—水提法沒有抑制酶活性，糖提取量最低。

3.3 實際應用

乙醇法雖然能測得更準確的可溶性糖含量，但提取糖后需要除掉乙醇導致試驗耗時較長，如本試驗采用65 ℃烘箱進行濃縮，耗時將近48 h，而且步驟繁瑣、費時費力。水提法則步驟簡單、省時省力，加以殺酶處理后提取率較高。因此，在提取果實可溶性糖時，若要獲得盡可能精確的含量數據，以殺酶—乙醇法最好；若需要測定大樣本果實的可溶性糖，以殺酶—水提法為宜。龍眼屬于糖直接積累型[19]，對于淀粉轉化型和中間類型的果實需進一步比較分析。