中藥0 期臨床藥代動力學試驗探索＊

于雪峰，李國信，梁麗喆，李丁蕾

（遼寧中醫藥大學附屬第二醫院 沈陽 110034）

0 期臨床試驗，又稱探索性新藥臨床研究（exploratory investigational new drug，eIND）或探索性臨床試驗（Exploratory Clinical Trial），是指在臨床前實驗結束，對動物身上檢測到、尚不充分的實驗數據，以短時間、小樣本、小劑量的方式，在人體進行未上市新藥的臨床驗證旨在考察臨床前數據的人體藥代/藥效學參數重現性，為藥物研發的進一步取舍提供依據[1-3]。

結合中藥“多組分、多靶點”的自身特點，本研究在藥物選擇和實驗設計上較西藥0期臨床試驗均做出相應調整，選擇舒血寧注射液進行中藥0 期臨床試驗的方法學探索。舒血寧注射液是從銀杏葉中提取并制備的滅菌水溶液，具有改善微循環、擴張血管等作用，臨床常用于缺血性心腦血管疾病。舒血寧注射液成分包括銀杏內酯A、B、C，白果內酯和黃酮類，但在前期的藥物成分含量檢測中，除銀杏內酯A、B、C 外，其他成分均低于檢測下限。本文以舒血寧注射液的0期臨床藥代動力學示范研究，探索中藥在臨床評價中進行0 期臨床藥代動力學試驗的可行性，對所建立試驗方法進行驗證[6]。

1 實驗材料

1.1 藥品試劑

舒血寧注射液（黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，規格：5 mL：17.5 mg，批號：B20140907）；對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，其中銀杏內酯A（批號：110862-201310，含量：98.9%）；銀杏內酯B（批號：100861-201310，含量：98.9%）；銀杏內酯C（批號：10081-201408，含量：98.9%）；甲醇（色譜純，德國默克公司，批號：1503907 940），甲酸（色譜純，迪馬科技有限公司，批號：4293980），乙酸乙酯為（化學純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160105）。

1.2 儀器

LC-MS/MS 聯用儀（美國安捷倫公司，型號：6410型），Quantitative Analysis version B.01.04 數據處理系統，ESI 離子源；微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠，型號：XW-80A）；分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：XS-105）；低溫高速離心機（德國SIGMA公司，型號：SIGMA3-18A）。

2 實驗方法

2.1 試驗設計

分為微劑量試驗（10 人），單劑量爬坡試驗（每劑量組2人，共5組），低劑量試驗組（血藥濃度最小檢測值劑量10 人）和臨床劑量對照組（10 人），以此考察微劑量、低劑量與臨床劑量給藥間的藥代動力學規律。

2.2 受試者選擇

32 名健康志愿者，男女各半，年齡20-45 歲，體重指數19-24；心電圖、血尿常規、凝血、肝腎功能等檢查指標均在正常范圍值區間；無煙、酒嗜好；獲取知情同意并志愿受試者。

2.3 給藥方法及血樣采集

給藥方法：受試者隨機分至各劑量組。微劑量組給藥參照FDA 標準，予100 μg 藥物進行試驗[5-8]；單劑量爬坡組根據倍數分布，設立參考劑量70 mg 的1/100，1/50，1/25，1/12.5，1/6.25即0.7 mg，1.4 mg，2.8 mg，5.6 mg和11.2 mg共5個劑量進行試驗給藥[9]；低劑量試驗組劑量以單劑量爬坡組檢測結果為參考；臨床劑量對照組以70 mg進行相同溶液劑量（100 mL）給藥。

血樣采集：受試者于試驗當天早晨用藥前1 小時統一進食，隨后開始試驗，將配制好的100 mL溶液，按一定滴速靜脈滴注，30 min靜點完畢。于給藥前（0 h）、滴注開始后5 min、10 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h 從肘靜脈取血，每次5 mL，采血后將血液樣品置于肝素化試管中，離心（4℃，4000 rpm，10 min），分離得血漿，于-70℃冰箱貯存至測定[10]

2.4 色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱：AglientPoroshell 120 SB-C18，4.6 mm×75mm，2.7 micron；流動相：乙腈：水（含0.1%甲酸）為50：50，流速0.3 mL·min-1；柱溫40℃；進樣量為10 μL。

質譜條件：ESI 離子源：載氣流速9 L/mL，載氣溫度300℃，霧化氣壓力40 psi，毛細管電壓4000 V；選擇多反應監測（MRM）方式，正離子模式檢測，用于定量的離子分別為：銀杏內酯A m/z：409.1→345.0，誘導電壓195 V，碰?能19 V；銀杏內酯B m/z：425.0→361.2，誘導電壓180 V，碰?能17 V；銀杏內酯C m/z：441.1→325.0，誘導電壓190 V，碰?能19 V；200 ms掃描時間。

2.5 血漿樣品處理：

精密量取500 μL血漿，離心管渦旋30 s，精密加入1 mL 乙酸乙酯，渦旋2 min 后，14 000 rpm·min-1離心10 min，取800 μL上清液，40℃水浴氮氣吹干，80 μL流動相溶解殘渣，10 μL進樣。

2.6 數據處理

采用WinNonlin 6.3 軟件對受試者體內的藥時曲線進行非房室模型擬合，采用SPSS軟件對舒血寧注射液不同劑量組之間的藥動學進行比較。

3 實驗結果

3.1 方法學考察與評價

經方法學考察，血漿內源性雜質不干擾樣品的測定，銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C在選定的色譜和質譜條件下專屬性良好；銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C線性范圍分別為1.0017-40.0680 μg·L-1（r=0.9921），1.0200-40.7992 μg·L-1（r=0.9957），0.4740-14.2192 μg·L-1（r=0.9923），定量下限分別為1.0017、1.0200、0.4740 μg·L-1（S/N＞10）；日間和日內精密度RSD值均小于15%（n=6×3）；基質效應均在85%-115%之間（RSD＜15%）；經室溫放置24 h，反復凍融、長期冷凍30 d 穩定性考察，樣品均能保持穩定（RSD＜15%），符合生物樣品分析方法要求，結果（見表1，表2）。

3.2 微劑量與單劑量爬坡組藥動學結果

受試者注射不同劑量舒血寧注射液后的血漿樣品中銀杏內酯A、B、C 的血藥濃度-時間曲線(如圖1)所示，經計算機擬合，藥代動力學參數統計（見表3-表5）。

3.3 低劑量試驗組與臨床劑量對照組藥動學比較結果

根據單劑量爬坡劑量組結果，選取銀杏內酯A、B、C檢測均超過9個時間點的劑量組（11.2 mg）作為低劑量試驗組給藥劑量，與臨床劑量對照組比較如表6；低劑量試驗組與臨床劑量對照組分別對AUC(0-∞)，Cmax，t1/2z和MRT(0-∞)藥動學參數比較，結果（見圖2）。

低劑量試驗組與臨床劑量對照組相比，舒血寧注射液的t1/2，Tmax和MRT 相近，不隨劑量的改變而變化；AUC0-t，AUC0-∞和Cmax均與劑量呈正相關，提示在此劑量范圍，舒血寧注射液在健康受試者體內呈線性藥代動力學特征，低劑量試驗能夠一定程度上反應臨床給藥劑量在人體內的代謝規律。

4 討論

0期臨床試驗在國外的應用并不普遍，中藥0期的開展在文獻中尚未見明確報道。相較于西藥采用探針或熒光顯影技術對藥物進行生物標記來檢測藥物在體內分布，多組分多靶點的中藥進行0 期臨床評價顯得尤為困難。

藥物選擇方面：本研究在西藥0 期臨床試驗藥物選擇的基礎上，選擇成分種類分明（如各種黃酮、內酯類等）、生物標記物相對確切（抗氧化、抗血小板聚集等）、代謝途徑相對單一的靜脈給藥中藥注射劑進行試驗，現代藥理研究比較簡單。

表1 精密度和回收率試驗結果(xˉ±SD,n=6×3)

表2 穩定性試驗結果(xˉ±SD,n=6×3)

圖1 血藥濃度-時間曲線

表3 銀杏內酯A藥動學參數(xˉ±SD,n=2)

表4 銀杏內酯B藥動學參數(xˉ±SD,n=2)

表5 銀杏內酯C藥動學參數(xˉ±SD,n=2)

表6 低劑量試驗組與臨床劑量對照組藥動學參數(xˉ±SD,n=10)

實驗設計方面：本研究在西藥0 期臨床微劑量給藥的基礎上，以《0期臨床試驗與中藥注射劑上市后臨床安全性再評價》單次給藥方式為依據，在規定的臨床劑量比值（1/6.25）范圍內，根據倍數分布關系，按照臨床給藥劑量的1/100、1/50、1/25、1/12.5、1/6.25，依次進行劑量爬坡試驗，以能檢測到的較為完整血藥濃度的劑量，探究藥代動力學參數。并采用已上市中藥舒血寧注射液，開設臨床給藥劑量對照組，以此種方法摸索中藥的最低藥理學劑量，為中藥進行早期臨床評價奠定基礎。

圖2 試驗低劑量組與臨床劑量組中3種成分藥動參數比較