溫腎益髓生血方對RA 大鼠腎臟PI3K/AKT 信號通路影響的研究＊

宋璐霞，張新雪，黃雅薇，張紫嫣，葛東宇，蔡京娩，趙宗江

（北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029）

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）是我國的常見病以及多發病，有報告指出，我國CKD 患者的人數約占10.8%，為1.195 億人[1]。CKD 是因各種原發、繼發性腎病引起的慢性、進行性腎損害，日久最終會發展為終末期腎病。腎性貧血（Renal anemia，RA）是CKD的主要并發癥之一，其主要原因是由于機體內促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）缺乏導致的缺血性損害，進而對機體造成損傷。在CKD 病程進展中，大約50%的CKDⅢ期-CKDⅤ期患者會出現貧血現象[2]且近年來調查研究發現，RA在CKD早期出現的比率也在逐漸升高[3]。可見，有效糾正腎性貧血狀態，對提高人們健康水平與生活質量有著重要的意義。現階段臨床上對RA主要使用重組人促紅細胞生成素（rhu-EPO）的方法治療，取得了良好的治療效果，但仍有約5%-10%的患者會出現EPO 抵抗，無法達到糾正貧血的效果[4]。故探究中醫藥對腎性貧血的治療便有了其獨特的意義。EPO是一種促進紅系祖細胞生長、增殖、分化和成熟的糖蛋白激素，主要由腎皮質的腎小管周圍成纖維細胞和內皮細胞產生[5]，有研究發現，EPO 與其受體結合后，能夠通過激活磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路進而達到影響細胞凋亡的作用[6]。本課題組已于前期證實溫腎益髓生血方對RA大鼠貧血狀態具有良好的糾正效果[7]。但該方能否通過激活與凋亡相關的PI3K/AKT信號通路，在糾正貧血狀態的基礎上達到抑制細胞凋亡保護腎組織結構的作用依舊有待于去探索。為此本實驗擬研究溫腎益髓生血方在腎性貧血中的腎臟保護作用及機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及藥物

雄性健康SPF級Wistar大鼠50只，體質量：150 g-170 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證號：SCXK 京2012-0001）采購；大鼠飼料，購于北京華康生物科技有限公司（批號：11003800009115）；實驗大鼠置于潔凈動物櫥（北京文慧凈化設備廠制造，專利號：EJ932041477）內飼養，飼養環境為23-25℃，適應性飼養1周。

腺嘌呤（amresco，A0183）；溫腎益髓生血方（組成：淫羊藿、補骨脂、熟地黃、黨參、山萸肉、制何首烏、炙黃芪、當歸、鱉甲、阿膠、雞血藤、砂仁，中國中醫科學院廣安門醫院制劑，批號京藥制字Z2006002，250 g·瓶-1，批號20160523)；生血寧顆粒（武漢聯合藥業有限責任公司，批號：20150712，國藥準字：Z20030088）。

1.2 實驗試劑及儀器

一 抗：EPO（AVIVA，OABF944）；PI3K（Novus,NBP2-67488）；AKT pan（CST，4691）；phospho-AKT（CST，4060）；bcl-2（abcam，ab59348）；β-Actin（CST,4970）二抗：山羊抗兔抗體（Abcam，ab6721）；L340099型普通光學顯微鏡（Olympus公司）；mikr002r型低溫高速離心機（Hettich公司）；rm2245型半輪轉式組織切片機（Leica公司）；vortex-5型渦旋振蕩器（北京東南儀誠實驗室設備有限公司）；7160型全自動生化儀（日立公司）；NIS Elements-BR 型圖像分析儀器（Nikon 公司）；MS205DU型精密電子天平（Mettler公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型及分組

健康雄性Wistar大鼠50只，適應性飼養1周后，按體質量隨機分為正常組10只、假手術組10只及造模組30 只，飼養至第2 周對除正常組大鼠外其余各組大鼠進行手術：假手術組大鼠僅將單側腎臟取出并分離包膜后納回，不行單側腎切除手術并縫合。對造模組大鼠進行單側腎切除手術并縫合后按照體質量分為模型組、生血寧組和溫腎益髓生血組。各造模組每日上午使用180 mg·Kg·d-1的腺嘌呤灌胃；正常與假手術組，用等體積去離子水灌胃；造模大鼠各項指標符合慢性腎衰竭[8]模型特點及合并血紅蛋白、紅細胞等指標符合貧血標準，即造模成功。造模第3 周，每日下午予2.33 g·kg·d-1生血寧與3.5 g·Kg·d-1溫腎益髓生血方對各治療組進行相應藥物灌胃治療，其余各組（正常、假手術、模型）予等體積去離子水灌胃，共治療12周。

2.2 觀察大鼠狀態及稱取體質量及腎重體重比

每日觀察各組大鼠精神狀態、皮毛光澤度、活動、飲食等情況；每周稱量各組大鼠體質量，12 周取材后留取腎臟病稱重。

2.3 腎臟病理學檢查

實驗12周后，對各組大鼠腹腔注射水合氯醛進行麻醉，取各組大鼠腎臟，制作石蠟切片，進行HE、Mallory染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織形態改變。

2.4 外周血象及血生化檢測

藥物治療12周后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉后取血，檢測血常規檢測紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）水平與血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）含量。

2.5 免疫組化法檢測相關指標

取腎組織石蠟切片逐級脫蠟至水，進行免疫組化實驗，具體操作步驟參考文獻[9]。

2.6 原位雜交法檢測相關指標

取腎組織石蠟切片逐級脫蠟至水，進行原位雜交實驗，具體操作步驟參考文獻[7]。

2.7 圖像分析

免疫組化、原位雜交每組隨機選取8個視野，使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對實驗結果進行分析，測定OD值；

2.8 統計學方法

使用SPSS 20.0統計軟件對數據進行統計分析，數據用（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析進行組間比較，P ＜0.05 差異有統計學意義，P ＜0.01 差異有顯著統計學意義。

3 實驗結果

3.1 一般狀態

正常組和假手術組大鼠精神及活動狀態均正常，四肢肌肉正常，耳廓爪甲顏色紅潤，皮毛光亮，體重隨著飼養時間增加明顯，飲食二便均正常；模型組大鼠于造模12天開始出現精神不振，蜷縮喜靜，肌肉萎縮，皮毛晦暗，體重明顯下降，部分大鼠造模后期出現血尿；治療組大鼠較模型組大鼠表現均有不同程度的改善。

表1 溫腎生血方對腎性貧血大鼠體質量的影響（xˉ±s，g）

附圖1 溫腎益髓生血方對各組大鼠腎組織形態學影響（HE，Mallory,400×）

表2 溫腎生血方對腎性貧血大鼠外周血象的影響（xˉ±s）

3.2 溫腎益髓生血方對RA大鼠體質量及腎重體重比的影響

治療0-3周各組大鼠體重差異不明顯，從治療第4周開始，模型組大鼠體質量較正常組及假手術組大鼠體質量明顯下降，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01）；各治療組體質量較模型組均有增加，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01）。

實驗第12 周取材，留取各組大鼠腎臟并稱取腎重，模型組大鼠腎重體重比明顯高于正常組與假手術組，有顯著差異（P ＜0.01）；與模型組比較，各治療組腎重體重比均明顯增高（P＜0.01）（表1）。

3.3 腎組織病理形態影響

HE 染色結果：正常組及假手術組，腎組織結構正常；模型組：腎小管管腔出現嚴重擴張現象，且小管及間質中可見大量金黃色腺嘌呤結晶，腎間質嚴重纖維化，腎小球數量減少；各治療組：與模型組比較，腎小球數量增多，腎小球及腎小管形態有所改善，腎間質纖維化程度減輕，管腔內可見少量腺嘌呤結晶（附圖1）。

Mallory 染色結果：正常組與假手術組呈正常腎組織結構，腎小球及腎小管內有少量纖維；假手術組可見腎間質重度纖維化，腎小管管腔變形擴張，可見黃色腺嘌呤結晶；治療組較模型組間質纖維化程度減輕，腎小管管腔中度擴張（附圖1）。

3.4 溫腎生血方對RA 大鼠外周血象及血生化指標檢測

3.4.1 溫腎生血方對腎性貧血大鼠外周血象的影響

模型組大鼠外周血RBC、HGB 較正常與假手術組顯著降低，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01），生血寧組和溫腎生血組外周血RBC、HGB 較模型組顯著升高，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01）（表2、圖1、圖2）。

圖1 溫腎生血法對腎性貧血大鼠外周血RBC的影響

圖2 溫腎生血法對腎性貧血大鼠外周血HGB的影響

圖3 溫腎益髓生血方對腎性貧血大鼠Scr的影響

圖4 溫腎益髓生血方對腎性貧血大鼠BUN的影響

表3 溫腎益髓生血方對腎性貧血大鼠Scr、BUN、UA的影響（xˉ±s）

3.4.2 溫腎生血方對RA 大鼠血清Scr、BUN、UA 的影響

模型組大鼠血清肌酐、尿素氮、尿酸較正常與假手術組大鼠均顯著升高，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01），各治療組大鼠較模型組血清肌酐、尿素氮、尿酸水平顯著降低，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01）（表3，圖3、圖4、圖5）。

3.5 溫腎生血方對腎組織EPO、PI3K、AKT、p-AKT、bcl-2蛋白表達的影響

圖5 溫腎益髓生血方對腎性貧血大鼠UA的影響

與正常組及假手術組比較，模型組EPO、PI3K、p-AKT/AKT、bcl-2表達明顯減少（P ＜0.01）；與模型組比較，溫腎生血組EPO、PI3K、p-AKT/AKT、bcl-2表達增加（P ＜0.01），具有顯著差異（表4、5，圖2）。

表4 溫腎生血方對腎組織EPO、PI3K、bcl-2蛋白表達的影響（OD,xˉ±s，n=8）

表5 溫腎生血方對腎組織p-AKT、AKT、p-AKT/AKT蛋白表達影響（OD,xˉ±s，n=8）

附圖2 溫腎生血方對腎組織EPO、PI3K、p-AKT/AKT、bcl-2蛋白表達的影響（400×）

3.6 溫腎生血方對腎組織EPO、PI3K、AKT、bcl-2mRNA表達的影響

與正常組及假手術組比較，模型組EPO、PI3K、bcl-2表達明顯減少（P ＜0.01）；與模型組比較，溫腎生血組EPO、PI3K、bcl-2 表達增加（P ＜0.01），具有顯著差異；各組AKT表達無明顯差異（表6，附圖3）。

表6 溫腎生血方對腎組織EPO、PI3K、AKT、bcl-2mRNA表達影響（OD,xˉ±s，n=8）

附圖3 溫腎生血方對腎組織EPO、PI3K、AKT、bcl-2mRNA表達的影響（400×）

4 討論

腎性貧血是慢性腎臟病的主要并發癥之一，尿毒癥毒素、炎癥反應、營養不良以及出血等因素已被證實與腎性貧血密切相關,貧血日久不愈加重慢性腎臟病的進程，使其發展為終末期腎病，其中腎纖維化是慢性腎臟病發生和發展的共同途徑和主要環節。細胞凋亡對于維持腎細胞數量在平穩狀態起相當重要作用[10]。大量研究結果表明，細胞凋亡現象在腎臟疾病中貫穿始終[11]。在腎臟疾病患病初期，腎臟各細胞的增生通常會出現細胞凋亡現象；而在腎臟疾病中后期，細胞凋亡現象的加劇導致腎臟固有細胞減少，腎臟萎縮，繼而出現腎小球硬化及間質纖維化現象[12]。EPO 介導的PI3K/AKT 通路對腎臟保護作用之一體現在其抗腎固有細胞凋亡方面上[13]。

PI3K 是由調節亞基p85 與催化亞基p110 組成的異源二聚體，二者結合后能夠激活其下游因子Akt，使Akt 向細胞質和細胞核內轉運，并使底物蛋白特定部位的絲、蘇氨酸磷酸化產生p-Akt，p-Akt 對bcl-2、bad及bax等細胞因子具有調節作用，發揮其抗凋亡、保證細胞生存的作用[14]。在腎臟中，有研究發現PI3K/AKT通路的激活能夠抑制腎足細胞凋亡[15,16]，新型促紅細胞生成素衍生肽可以通過活化該條信號通路，進而減輕腎臟缺血再灌注損傷后腎小管上皮細胞損傷程度和凋亡水平，腎臟保護作用[17]，那么在腎性貧血中，該通路是否同樣能夠起到抗凋亡作用值得我們進一步去探索。

腎性貧血歸屬于中醫學的“虛勞”、“血虛”等范疇。腎藏精，主骨生髓，精血同源。故在腎性貧血疾病中，腎中陽氣不足或腎主封藏功能的失司均會導致腎精不足，腎精不足則無源以化血故而導致貧血。本課題組于前期基于“精髓化血理論”使用補腎益髓生血法治療再生障礙性貧血取得了一定的成果，探討了補腎益髓法對再生障礙性貧血相關的分子機制及藥物的作用靶點[18,19]，并初步構建了“腎髓系統”的理論框架。溫腎益髓生血方，是在此理論基礎之上，在補腎益髓生血方中加以溫補腎陽之淫羊藿而成。方中山茱萸、何首烏為主藥，具有補肝腎益精血之功效；補骨脂、熟地黃助君藥補益精血，加強全方補腎益精血之效；炙黃芪、黨參健脾益氣，顧護脾胃之氣，防滋膩藥物損傷脾胃，又寓“氣行則血行”，使全方補而不滯；阿膠、當歸養血補血；雞血藤、鱉甲活血化瘀；加以溫補腎陽的淫羊藿使全方共奏溫腎健脾，益髓生血的功效。本實驗在前期工作基礎之上，探討溫腎益髓生血方對RA 大鼠貧血狀態的糾正及其對腎組織保護作用機制是具有一定臨床應用價值的。

在本實驗中，RA大鼠腎臟大體觀察可見腎臟體積增大，質地松軟，色白，腎臟病理組織可見腎小管管腔嚴重擴大，且能觀察到管內大量金黃色腺嘌呤結晶沉積及重度腎間質纖維化。溫腎益髓生血方可以改善腎性貧血大鼠的一般狀態，如蜷縮、消瘦、爪甲色白等癥狀；同時，RA 大鼠腎臟病理改變明顯減輕，血清Scr、BUN、UA 含量降低，說明腎功能有所改善；血中RBC、HGB水平升高，說明貧血狀態改善，作用顯著。

免疫組化結果表明，腎性貧血大鼠腎組織中EPO、PI3K、p-AKT/AKT、bcl-2 蛋白表達水平均顯著降低。進行給藥治療后，EPO、PI3K、bcl-2 蛋白顯著增高；總AKT 各組間無明顯差異，而p-AKT/AKT 則明顯升高。實驗結果說明，溫腎益髓生血方可能通過增加EPO表達進而激活PI3K/AKT 信號轉導通路相關蛋白表達，其中PI3K/AKT通路激活主要通過改變p-akt表達實現的，進而達到對腎組織的抗凋亡作用，起到對腎組織的保護目的。