基于蛋白免疫印跡的水蛭抗凝活性成分研究＊

程 珊，汪 波，肖 凌，聶 晶＊＊，鄭 健

（1.湖北省藥品監督檢驗研究院 武漢 430064；2.湖北中醫藥大學藥學院 武漢 430065；3.中國食品藥品檢定研究院 北京 100010）

水蛭，又稱螞蟥，具有破血、逐瘀、通經功效的功效，始載于《神農本草經》[1]。中國藥典規定，水蛭藥材來源為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman（即寬體金線蛭)、水蛭Whitmania pigra Whitman、Hirudo nipponica Whitman（即日本醫蛭)或柳葉螞蟥Whitmania acranulate Whitman（即尖細金線蛭)的干燥全體[2]。近百年來人們在其分泌物中發現多種抗凝活性物質，如歐洲醫蛭中分離出的最強凝血酶抑制劑水蛭素[3,4]、凝血因子Ⅹa 抑制劑vizottin[5]和凝血因子XIIIa 抑制劑Tridegin[6]等。然而當前仍只有水蛭素進入臨床，其他有效成分還在研究之中。日本醫蛭為吸血性水蛭，唾液中含有水蛭素；寬體金線蛭為國內市場最常見的非吸血類水蛭，萬明研究發現加熱提取寬體金線蛭并不影響抗凝血物質的活性[7]，而水蛭素在加熱條件下易被破壞[8]，說明寬體金線蛭內含有與水蛭素不同的抗凝物質，其有效抗凝成分仍待進一步研究。本研究總結前人研究成果，提出利用NP-40裂解液提取水蛭總蛋白，凝血酶滴定法測定抗凝血酶活性，將總蛋白與凝血酶混合后，采用Native-PAGE-Western Blot（簡稱Native-PAGE-WB）的方法檢測凝血酶與活性抗凝成分的相互作用。

1 儀器與試藥

Thermo Scientific Sorvall Legend MicroPICO 17/21微量離心機；BioRadFireware Version 1.07 PowerpacTMHC 電源，Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽；Hoefer TE77XP 轉膜儀；Amersham?Imager 凝膠成像儀。

NP-40、預染蛋白Marker、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自生工生物公司；Amicon Ultra-0.5 3kD超濾管購自Millipore 公司；凝血酶標準品購自sigma 公司；纖維蛋白原（牛血）購自中國食品藥品檢定研究院；凝血酶兔單克隆抗體購自abcam 公司；羊抗兔IgG-HRP 購自武漢塞維爾公司；BeyoECL Star（特超敏ECL 化學發光試劑盒）購自碧云天生物技術有限公司。

寬體金線蛭采集自山東省濟寧市徽山湖），日本醫蛭采集自湖北省荊州市公安縣青吉工業園）。

表1 水蛭提取物蛋白含量及抗凝血酶活性（n=3）

圖1 水蛭總蛋白15%SDS-PAGE電泳(n=3)

圖2 日本醫蛭唾液蛋白+凝血酶Native-PAGE電泳考染及western blot結果(n=3)

2 方法與結果

2.1 日本醫蛭、寬體金線蛭樣品制備

2.1.1 日本醫蛭唾液蛋白

活體日本醫蛭喂食NaCl誘導分泌唾液，收集唾液后離心取上清，3 kDa超濾管脫鹽后冷凍干燥成粉末保存。

2.1.2 日本醫蛭、寬體金線蛭蟲體總蛋白

取適量日本醫蛭、寬體金線蛭干品，研磨成細粉，用約10 倍體積60-90℃石油醚冰水浴超聲脫脂，傾出石油醚，揮干剩余殘渣。取冰預冷的NP-40 裂解液（20 mmol·L-1Tris-HCl，137 mmol·L-1NaCl，10%甘油，1%NP-40），按20 mg：250 μL 的比例加入向殘渣中裂解液；冰水浴超聲至充分裂解后4℃，13 000 r·min-1離心15 min；吸取離心后的上清液于3 kDa超濾管中，4℃，4 000 r·min-1離心1 h，棄去管芯內沉淀后即為總蛋白樣品，置-40℃保存。用BCA法測定蛋白濃度；用藥典2015版一部水蛭含量測定方法測定抗凝血酶活性，測定結果見表1。

2.2 水蛭總蛋白組分SDS-PAGE電泳

配制5%濃縮膠和15%SDS-PAGE 分離膠，取2.1項下總蛋白樣品及日本醫蛭唾液蛋白作變性處理后離心取上清加樣。先以100 V 恒壓電泳至分離膠，再調為250 V恒壓20 min；考馬斯亮藍染色液染色4 h；傾去染色液，加入脫色液脫色，直至獲得藍色條帶及干凈的背景，拍照保存，結果見圖1。

2.3 水蛭總蛋白+凝血酶Native-PAGE-WB實驗

配制5%濃縮膠和6%Native-PAGE 分離膠，加樣蛋白Marker，凝血酶，日本醫蛭唾液蛋白，凝血酶與日本醫蛭唾液蛋白各混合后上樣；以上每份樣品于同一塊6%Native-PAGE 膠平行上樣兩個泳道，一份行WB檢測，另一份考馬斯亮藍染色。先以100V恒壓電泳至分離膠，再調為250V 恒壓20min 到電泳結束，冰水浴使電泳槽溫度維持低溫。電泳結束后，將行WB 檢測的聚丙烯酰胺凝膠沿垂直方向切下置于轉膜儀中，75 mA轉膜25 min；5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000凝血酶一抗室溫孵育2 h，1∶3 000 羊抗兔IgG-HRP 孵育1 h，洗膜后按BeyoECL Star 試劑盒所提供的方法孵育PVDF膜1-3 min后，AI600凝膠成像系統拍照，western blot結果見圖2a及圖2b泳道1、2、3、4。寬體金線蛭總蛋白同法操作，western blot結果見圖3a及圖3b泳道1、2、3、4。

電泳結束后將6%Native-PAGE膠的另一半剝下，置于考馬斯亮藍染色液染色4h；傾去染色液，更換脫色液脫色，直至獲得藍色條帶及干凈的背景，拍照保存，考染結果見圖2b 泳道5、6、7、8。寬體金線蛭總蛋白同法操作，考染結果見圖3b泳道5、6、7、8、9。

2.4 蛋白質復合體條帶切膠回收

膠內蛋白質回收的方法改進自王曉東的研究成果[9-10]。沿邊緣切取2.3項下經考馬斯亮藍染色的蛋白質復合體膠帶（圖2b泳道7、8；圖3b泳道5、6框內標注處），用研磨棒研碎，加入脫色液（50%ACN/25mM NH4CO3）震蕩脫色至無色；離心后吸除上清，用ACN使凝膠完全脫水后揮干；隨后加入適量0.25%NH3·H2O溶液使凝膠完全浸沒，充分混勻后置于冰水浴超聲萃取膠內蛋白質25 min；離心取上清至新的離心管中，剩余的膠粒用少量去離子水清洗3 次后，洗滌液合并萃取液；隨后將萃取溶液真空冷凍干燥至固體。

2.5 蛋白質復合體SDS-PAGE-WB實驗

配制5%濃縮膠和12%SDS-PAGE 分離膠，將2.4項下回收蛋白質復合體用Milli-Q水溶解，另取適量凝血酶標準品，分別加5×SDS-PAGE 作變性處理后離心取上清上樣25 μL。先以100V恒壓10 min電泳至分離膠，250 V 恒壓到電泳結束；后續操作同2.3，western blot結果見圖4。

3 討論

3.1 日本醫蛭、寬體金線蛭總蛋白及其活性分析

水蛭素（hirudin） 是迄今發現最強的凝血酶特異性抑制劑[4]，是水蛭中具有代表性的藥理活性物質，是否含有水蛭素以及其含量的多寡可以作為藥用水蛭功效的一個重要檢驗標準[11]。市場常見的水蛭藥材中，吸血型水蛭日本醫蛭中可提取出水蛭素[12]，而非吸血型水蛭寬體金線蛭不含水蛭素，且其干品與鮮品中纖溶活性基本相同，說明此纖溶物質并不是來源于唾液腺，是不同于水蛭素的活性物質[13]，故本研究并未考察寬體金線蛭唾液。

應用較為溫和的NP-40 裂解液提取總蛋白，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下實現凝血酶-活性多肽復合體與其他成分的分離，極大簡化了有效成分分離純化的過程，最大程度地保留活性蛋白，相比RIPA裂解液[14]避免了變性劑對蛋白質活性的破壞，相比丙酮浸提法，醇浸提法[15]減少有機試劑的疏水結合導致的蛋白變性。表1水蛭提取物蛋白含量及抗凝血酶活性測定結果表明：NP-40裂解液提取寬體金線蛭、日本醫蛭總蛋白能有效保留其抗凝活性，其中寬體金線蛭提取物抗凝活性（1.06 U/mg）高于李寶紅[16]經過DEAE Sephadex A-50、Sephadex G-50 凝膠柱分離純化所得抗凝組份活性（225.28±1.03 U/g）。圖1 總蛋白SDSPAGE 電泳圖表明日本醫蛭唾液蛋白分子量集中在20 kDa以下肽段；日本醫蛭、寬體金線蛭蟲體提取物蛋白分子量從10-250 kDa 均有分布，此結果與汪波等[12]RIPA裂解液提取水蛭總蛋白研究成果相似。

圖3 寬體金線蛭總蛋白+凝血酶Native-PAGE電泳考染及western blot結果(n=3)

3.2 western blot 結果分析

寬體金線蛭是目前國內藥材市場最常見的水蛭藥材，其抗凝成分一直是國內研究者的熱點，如任堯采用Alcalase 酶解寬體金線蛭分離蛋白，通過離子交換色譜、凝膠過濾色譜、RP-HPLC純化后，得到具有抗凝活性的產物WA3-1[17]。Zheng等發現寬體金線蛭中分離出的活性寡肽具有耐熱特性[18]。利用水蛭素和凝血酶相互作用特性[19]，將日本醫蛭唾液與凝血酶混合后進行Native-PAGE-WB實驗，可見水蛭素-凝血酶復合物條帶（圖2a 泳道3、4、6、7，圖2b 泳道3）。由此建立的Native-PAGE-WB 的方法應用于寬體金線蛭總蛋白與凝血酶混合物體系中，檢測到的蛋白復合體條帶位置明顯區別于凝血酶單體（圖3a、圖3b），且寬體金線蛭總蛋白與凝血酶混合比例不同，復合物條帶位置略有不同（圖3a 泳道2、3、4、5）。為便于回收實驗選點切膠，選取寬體金線蛭總蛋白與凝血酶體積比2∶1（圖3b泳道5、6）進行后續實驗；實驗結果表明寬體金線蛭中抗凝血酶活性多肽與凝血酶可能形成不同比例結合復合體。復合體在加熱變性過程中失去相互作用力，蛋白電泳分離后出現同凝血酶單體相同條帶（如圖4 泳道6、7、8），結果表明了寬體金線蛭中含有與凝血酶結合的活性多肽，且能與凝血酶穩定結合形成復合體。