淫羊藿苷對(duì)前列腺癌原位移植瘤模型小鼠雄激素受體信號(hào)通路的影響＊

何華瓊，饒 紅，鄭 君，陳德森＊＊

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 十堰 442000；2.十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 十堰 442000）

中老年男性是前列腺癌（Prostatic Cancer，PCa）的高危人群，是男性罹患腫瘤中發(fā)病率及死亡率僅次于肺癌的惡性腫瘤，也是男性生命健康的主要威脅[1]。雄激素受體（Androgen Receptor，AR）是雄激素受體信號(hào)通路的重要組成部分，主要參與雄性激素的合成和代謝[2]。研究表明，磷酸化AR（p-AR）是AR 激活的重要途徑，激活后的AR與雄性激素結(jié)合，參與前列腺上皮細(xì)胞的分化和增殖，因此，有理由認(rèn)為在PCa的發(fā)生和發(fā)展中，雄激素受體信號(hào)通路中的AR 過表達(dá)可能是促進(jìn)PCa 發(fā)生發(fā)展的主要靶點(diǎn)[2,3]。另有研究表明，抑癌基因張力蛋白同源第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶基 因（Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome Ten，PTEN）在多灶性前列腺腺癌中表現(xiàn)出特異性，其突變率在PCa 患者中顯著高于正常人，PTEN 基因缺失可能導(dǎo)致前列腺上皮細(xì)胞無限生長而引 發(fā) 癌 變[4,5]。PCa 特 異 性 抗 原（Prostate Specific Antigen，PSA）是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的前列腺腫瘤標(biāo)志物，PSA檢測(cè)值有助于PCa的診斷、鑒別診斷及療效評(píng)價(jià)[6]。在對(duì)PCa原位移植瘤的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以通過調(diào)控P13K/Akt 信號(hào)通路而抑制人前列腺癌細(xì)胞（LNCaP）的生長和遷移[7,8]。而其針對(duì)PCa密切相關(guān)的雄激素受體信號(hào)通路的影響卻鮮有研究，有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)為彌補(bǔ)這一缺憾，首先采用前列腺腺體背外側(cè)包膜內(nèi)注射LNCaP懸液的方法構(gòu)建PCa原位移植瘤模型，再用不同劑量的淫羊藿苷溶液灌胃給藥治療5周的方法來觀察其對(duì)雄激素受體信號(hào)通路的影響，探討其影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SCID品系小鼠64只，雄性，鼠周齡為5-6周，體質(zhì)量（20.00±1.50）g。購自湖北醫(yī)藥學(xué)院附實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠質(zhì)量合格證為SCXK（鄂）2018-001，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施合格證為SYXK（鄂）2018-001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，在實(shí)驗(yàn)中遵偱3R原則，給予動(dòng)物人道關(guān)懷并保證動(dòng)物的福利。實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)期間，飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料并自由飲水，動(dòng)物房自然采光，相對(duì)濕度在50%-75%之間，溫度為22℃-24℃之間。采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)均分為移植瘤組、10 mg·kg-1組、40 mg·kg-1組和80 mg·kg-1組，共4組，每組16只。

1.2 主要藥品及試劑

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SI8020），LNCaP細(xì)胞株（上海酶研生物科技有限公司，批號(hào)：0712633-012），無水乙醚（廣州錢盛化工有限公司，批號(hào)：018214）；EDTA、胎牛血清（FBS）和RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基由賽默飛公司提供；PTEN、AR、PSA 和磷酸化AR（p-AR）檢測(cè)用試劑盒均由南京森貝伽生物科技有限公司提供（批號(hào)分別為：H1973，H1979，H018104，H018107）。

1.3 動(dòng)物模型制備與治療

先將凍存的LNCaP 細(xì)胞株于37℃速融，然后接種于RPMI-1640培養(yǎng)液中復(fù)蘇，培養(yǎng)箱怛溫37℃、通5%CO，培養(yǎng)3 天，每天換RPMI-1640 培養(yǎng)液一次，然后0.25%EDTA 消化后收集細(xì)胞，將收集的LNCaP 用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成2×107個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液用于造模。術(shù)前12 h 禁食不禁水，造模時(shí)用乙醚麻醉4組小鼠，下腹部消毒，然后切開皮膚并分離腹膜，此時(shí)充盈的膀胱會(huì)向外突出，用無菌棉簽將膀胱推向尾端以充分暴露小鼠生殖腺葉狀肉紅色前列腺腺體（左右共2 葉）。將調(diào)制好的LNCaP 細(xì)胞株于左右2 葉前列腺腺體的背外側(cè)包膜內(nèi)各注射25 μL 即可[9]。注射造模后還原組織器官并分層縫合皮膚，單籠飼養(yǎng)造模后小鼠，本實(shí)驗(yàn)為無菌手術(shù)，注意避免感染。2 周后，除移植瘤組灌生理鹽水對(duì)照外其它3組灌胃給予相應(yīng)劑量的淫羊藿苷，1次·天-1，治療5周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

在灌胃給藥治療前及治療后，各組分別取小鼠8只，處死后摘取小鼠前列腺腺體，剝?nèi)∏傲邢偕系哪[瘤瘤體并編號(hào)，用濾紙吸干后稱重并測(cè)量前列腺瘤體（長、短徑各測(cè)3 次后取平均值）。計(jì)算4 組腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=（C-T）÷C×100%，T為實(shí)驗(yàn)組平均瘤重；C為移植瘤組平均瘤重[10]。將前列腺上的腫瘤瘤體剪碎后加入裂解液，沖打混勻，提取總RNA。采用western blotting 檢測(cè)PSA 和p-AR 相對(duì)表達(dá)量，用Quantity One 軟件分析PSA 和p-AR 灰度值[11]。采用RT-PCR檢測(cè)AR和PTEN基因相對(duì)表達(dá)量。采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)前列腺體腫瘤瘤體LNCaP 細(xì)胞在腫瘤瘤體增殖周期[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢測(cè)數(shù)據(jù)用（xˉ±s）表示，多組間檢驗(yàn)先進(jìn)行多因素方差分析，符合正態(tài)分布的組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的組間比較采用校正LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對(duì)前列腺瘤體雄激素受體信號(hào)通路及PTEN的影響

移植瘤組治療前后AR mRNA 均高表達(dá)，PTEN mRNA 均低表達(dá)，治療前后組內(nèi)AR mRNA 和PTEN mRNA 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.073，0.097，P ＞0.05）。10 mg·kg-1組AR mRNA和PTEN mRNA治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.352，0.192，P ＞0.05）。而40 mg·kg-1、80 mg·kg-1組治療后PTEN mRNA 均高表達(dá)，AR mRNA 均低表達(dá)，與移植瘤組和同組治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表1）。

表2 4組PSA、p-AR 治療前后組間相對(duì)表達(dá)量比較（xˉ±s，n=8）

表3 4組腫瘤細(xì)胞生長比較（xˉ±s，n=8）

表4 4組LNCaP前列腺癌細(xì)胞周期比較（xˉ±s，n=8）

2.2 淫羊藿苷對(duì)前列腺瘤體雄激素受體磷酸化的影響

前列腺瘤體p-AR 和PSA 檢測(cè)顯示，移植瘤組PSA、p-AR治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.102，0.213，P ＞0.05）。10 mg·kg-1組PSA、p-AR治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.247，0.130，P ＞0.05）。而40 mg·kg-1組和80 mg·kg-1組治療后PSA、p-AR均低表達(dá)，與同組治療前和移植瘤組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.257，10.634，7.041，8.657，P ＜0.05）（表2）。

2.3 淫羊藿苷對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響

移植瘤組治療后瘤質(zhì)量和瘤體積均增大（t=4.835，6.974，P ＜0.05），而抑瘤率治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.143，P ＞0.05），提示移植瘤組腫瘤在繼續(xù)生長。治療后，10 mg·kg-1與同組治療前和移植瘤組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。40 mg·kg-1、80 mg·kg-1組治療后抑瘤率明顯提高，瘤質(zhì)量、瘤體積均降低，與同組治療前和移植瘤組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表3）。

2.4 淫羊藿苷對(duì)LNCaP細(xì)胞周期的影響（表4）

移植瘤組G0/G1和S 期比例治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。10 mg·kg-1治療后G0/G1和S期比例與同組治療前和移植瘤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。40 mg·kg-1、80 mg·kg-1組治療后G0/G1比值降低、而S期比例明顯升高，與同組治療前和移植瘤組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 討論

淫羊藿屬小檗科淫羊藿屬植物，味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕之功效。主治腎虛陽痿、遺精早泄、腰膝酸軟、筋骨攣急、風(fēng)濕痹痛等[13,14]。淫羊藿苷為中藥淫羊藿全草提取物，具有調(diào)節(jié)疫、抗腫瘤、抗肝纖維化、抑制骨質(zhì)疏松及增強(qiáng)去勢(shì)大鼠骨生物力學(xué)性能等作用[15,16]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有研究表明淫羊藿苷具有抑制PSA轉(zhuǎn)錄和AR磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)AR降解而發(fā)揮抗癌效應(yīng)[17,18]。

現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究表明，在細(xì)胞分化周期中，G0G1和S 期周期紊亂與腫瘤增殖密切相關(guān)，G0G1和S 期周期紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、分化與增殖失控，這會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限制的分化、增殖甚至惡化和轉(zhuǎn)移[19]。由此可見，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是惡性腫瘤生長的最基本的生物學(xué)特征，即腫瘤細(xì)胞失控性增殖，因此，目前在惡性腫瘤的治療過程，主要是利用藥物或其它方法將失控性增殖的腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M、G0/G1和S期[20]。AR屬性激素受體，雄激素與AR 結(jié)合后對(duì)維持前列腺干祖細(xì)胞正常分化具有重要作用。AR 過表達(dá)或過度磷酸化（p-AR）可促進(jìn)AR 向胞核轉(zhuǎn)移，加速列腺癌細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)移[21]。PTEN具有磷酸化酶活性，為腫瘤抑制基因，具有阻止AR乙酰化、降低AR活性的作用，對(duì)列腺癌細(xì)胞增殖、生長和轉(zhuǎn)移等方面具有一定的調(diào)控作用[22,23]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，移植瘤組治療前后AR mRNA均高表達(dá)，而PTEN mRNA 均低表達(dá)，前列腺瘤體p-AR、PSA、G0/G1和S期比例等指標(biāo)在治療前后差異無顯著性。且移植瘤組治療后瘤質(zhì)量和瘤體積均增大，抑瘤率治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果提示移植瘤組AR 發(fā)生乙酰化現(xiàn)象，PTEN 不能阻止AR 的乙酰化反應(yīng)，前列腺接種的LNCaP 細(xì)胞處于無序增殖，腫瘤在繼續(xù)生長，提示該方法可成功構(gòu)建PCa原位移植瘤模型。而治療后40 mg·kg-1組和80 mg·kg-1組PSA、p-AR 和AR mRN 相對(duì)表達(dá)量均低表達(dá)，而PTEN mRNA 高表達(dá)。另外，兩組治療后抑瘤率，瘤質(zhì)量、瘤體積均較同組治療前和移植瘤組明顯降低；且兩組治療后較同組治療前和移植瘤組G0/G1期比例降低、S 期比例明顯提高。這一現(xiàn)象說明淫羊藿苷抑制前列腺中LNCaP細(xì)胞增殖的機(jī)制應(yīng)與其抑制雄激素受體信號(hào)通路中AR 的磷酸化并增強(qiáng)PTEN 表達(dá)而將癌細(xì)胞增阻滯于S期有關(guān)。淫羊藿苷可能通過提高PTEN合成、抑制AR乙酰化而降低AR活性，將腫瘤細(xì)胞增殖阻滯于S 期。這一結(jié)果與饒紅等研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷抑制LNCaP細(xì)胞周期的生物學(xué)行為高度一致[24]。

上述研究結(jié)果表明，淫羊藿苷抑制LNCaP 增殖的機(jī)制應(yīng)與其抑制雄激素受體信號(hào)通路中AR的磷酸化并增強(qiáng)PTEN表達(dá)而將癌細(xì)胞增阻滯于S期有關(guān)，這為淫羊藿苷的后期開發(fā)及可能應(yīng)用于治療PCa提供了一定的參考。