瑤藥風濕骨痛噴霧劑對佐劑性關節炎大鼠的治療作用＊

王 杰，王 碩，蔣榮華，周小雷，龔小妹，韋桂麗，繆劍華＊＊

（1.廣西中醫藥大學藥學院 南寧 530299；2.廣西藥用植物研究所/西南瀕危藥材資源開發國家工程實驗室 南寧 530023）

類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種T，B 淋巴細胞參與的慢性系統自生免疫疾病[1]。該病好發于手、腕、足等小關節，并且反復發作，同時還會累及到人體的其他部位，輕者產生疼痛感，導致行動困難，重者會使關節畸形、功能受限，以致該部位失去正常活動的能力，甚至危害到生命，這種臨床上表現為慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變的疾病[2]，不僅給病人帶來了巨大的生理和心理上的痛苦，還給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。我國類風濕關節炎發病率約0.32%-0.36%，已經成為造成勞動力下降致殘的第一類疾病[3]，同時研究表明類風濕性關節炎患者的腫瘤發病率要明顯的高于正常人，目前國內外市場上用于治療類風濕關節炎的的方法多種多樣，最主要的手段是在病情發生不可逆性病變之前，即在病情的早期采取有效的治療措施。其用于治療的化學藥品主要包括：非甾體抗炎藥，糖皮質激素，免疫抑制劑，生物制劑，但這些藥物大多數只能對癥治療，延緩病情的發展，而不能對因治療，對病變畸形的組織、器官功能無法進行恢復，且具有一定的毒副作用。因此，越來越多的醫藥學家逐漸將目光轉投到中醫藥、民族醫藥等傳統醫藥學領域，以此來尋找治療類風濕關節炎更好地手段。

在我國瑤族是一個歷史悠久，同時富有特色的少數民族，是典型的南方山地民族，主要分布在廣西和湖南、云南、廣東、貴州等省，總人口有200 萬之多，其中廣西占全國瑤族人口152.8 萬，是全國瑤族人口的62%。瑤族分布的地區普遍為環境惡劣，氣候潮濕，導致比其他地區更容易使瑤族人民誘發類風濕關節炎等疾病，從而影響到瑤族人民的正常生活，在長期與疾病的斗爭中，瑤族人民逐漸有了本民族獨特的治療方法和藥物。廣西金秀瑤族自治縣是全國成立最早的瑤族自治縣，被稱為“瑤藥之都”，有“世界瑤藥文化研究中心在中國，中國瑤族研究文化在金秀”的美稱。瑤藥風濕骨痛噴霧劑是廣西金秀縣瑤醫醫院使用30 多年的傳統的臨床驗方，在傳統瑤醫的基礎上，該驗方是通過結合現代制劑技術開發研究而成的，主要由生斷腸草、兩面針、七葉一枝花、乳香、沒藥、九節風、木鱉子等瑤藥組成，具有祛風除濕、溫陽散寒、通絡止痛等功效，主要用于肢體關節疼痛，痛無定痛以及骨質增生等癥[4]，其中斷腸草又名大茶葉、大茶藥、鉤吻等，為馬錢科植物斷腸草（胡蔓藤）的根和葉[5]，外用具有祛風散瘀、消腫止痛的功能。現代藥理表明，其生物堿鉤吻素子具有鎮痛作用[6]。兩面針為蕓香科植物光葉花椒的根、莖，性辛、苦、微溫，有小毒，用于風濕痹痛、坐骨神經痛等多種病癥。本實驗通過完全弗氏佐劑造模方法誘導大鼠足趾出現繼發性腫大，考察瑤藥風濕骨痛噴霧劑對大鼠類風濕關節炎的影響，為瑤藥風濕骨痛噴霧劑對佐劑性關節炎大鼠的治療作用研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 藥品

風濕骨痛噴霧劑自制：斷腸草、兩面針、七葉一枝花、乳香、沒藥、九節風、木鱉子均購于廣西金秀縣，風濕骨痛噴霧劑由廣西藥用植物園西南瀕危植物工程實驗室制備。風濕骨痛噴霧劑處方除乳香、沒藥外藥材加10倍量80%乙醇超聲提取2 h，過濾。濾渣用5倍量80%乙醇超聲提取2 h 兩次，合并濾液，回收乙醇至3 L，加入乳香、沒藥，加熱溶解，待用。

消腫止痛酊（廣西壯族自治區花紅藥業有限公司，批號：20140505），雙氯芬酸鈉凝膠（先聲藥業，批號：35-150105）。

1.2 試劑

PGE2試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S16010958），TNF-α試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S24010957），RF 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S11010953），IL-1 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S14010955），IL-6 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S05010954）；弗氏完全佐劑（FCA，美國Sigma 公司，批號：098K8729）；氯化鈉注射液（昆明市宇斯藥業有限責任公司，批號：13010204）；乙醇消毒液（武漢市雪環醫用消毒用品有限公司，批號：20140507）；蒸餾水、去離子水均為實驗室自制。

1.3 實驗動物

雌性SD大鼠70只，體質量200±20 g，SPF級，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（桂）2009-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2009-0004。飼養條件：動物分籠飼養，保持晝夜節律，室溫（22±2）℃中，濕度60%，自由取食飲水。

1.4 儀器

CP224S 型分析天平（德國Sartorius 公司），TC30K型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），4K15型低溫高速離心機（美國sigma Sartoriu 公司），HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海天恒醫療器械有限公司），F200 型pro酶標儀（Tecan Infinite），自制排水體積法測試儀（精密度0.02 mL）。

1.5 實驗方法

取70只SD大鼠，雌性，適應性喂養1周后，隨機分為空白組、模型組、陽性組1（消腫止痛酊）、陽性組2（雙氯芬酸鈉凝膠）、風濕骨痛噴霧劑高、中、低劑量組，每組10只。造模方法參照文獻完全弗氏佐劑造模方法造模[7]。實驗第1天開始造模：空白對照組注射0.1 mL生理鹽水，其余各組于右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑（CFA）0.1 mL 致炎。第10 天，足趾出現繼發性腫大并加重，表示藥物造模成功。給藥方法為：將風濕骨痛噴霧劑配成高劑量（12.60 g·kg-1）、中劑量（6.30 g·kg-1）、低劑量（3.15 g·kg-1），按每100 g 體質量取0.1 mL 噴于致炎部位，用透明膠布包扎，保持3 h，每天1 次，空白組、模型組以噴霧劑所用溶劑代替；陽性組1（消腫止痛酊）、陽性組2（雙氯芬酸鈉凝膠）按照以上同樣方法處理。致炎后第21天各組停藥，繼續觀察3天。

采用排水體積法測量致炎足（原發性）和對側足（繼發性）致炎前后的體積，計算腫脹度與腫脹抑制率。

腫脹度=致炎后體積-致炎前體積

腫脹抑制率（%）=[（對照組腫脹度-給藥組腫脹度）/對照組腫脹度]×100%

大鼠致炎后第12 天開始觀察并記錄全身關節病變程度，每3天1次，全身病變按5級分法評價（0分：無紅腫；1 分：小趾關節紅腫；2 分：趾關節和足趾腫脹；3分：踝關節以下的足爪腫脹；4 分：包括踝關節在內的全部足爪腫脹）。根據未注射佐劑的余下肢體的病變程度累計積分，計算出AI（各個關節的積分累計起來，即為每只大鼠的AI）。停藥后3 天，大鼠禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛麻醉大鼠（0.3 mL·100g-1），大鼠翻正反應消失后，打開腹腔，用真空管腹主動脈取血，室溫靜置4 h，1 000 r·min-1，溫度為4℃，離心10 min，分離血清，分裝后，放入-20 ℃冰箱保存。在致炎側踝關節上方0.5 cm 處剪下炎性足腫脹，縱向切開，5 mL生理鹽水4℃浸泡2 h，離心取上清。按照試劑盒要求測定血清及炎性組織液中的PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF的含量。

表1 各組大鼠體質量的影響

表2 對AA大鼠致炎側（右后足）足趾腫脹度的影響（xˉ±s，n=10）

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行數據處理，兩組數據間比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，實驗數據用（xˉ±s）表示。

2 實驗結果

2.1 對各組大鼠體質量的影響

與空白組相比，模型組在第2 周、3 周有明顯的差異（P ＜0.01）；ROS高、中、低劑量組與空白組相比沒有明顯的差異（P ＞0.05）（表1）。

2.2 對AA大鼠足趾腫脹度的影響

造模后，2天足趾腫脹達到高峰，持續2-3天后，腫脹減輕，1周后再次出現腫脹，表明ROS能夠顯著抑制AA大鼠的足腫脹度。與模型組比較，ROS高劑量組在給藥15天后，對腫脹出現明顯的抑制作用（P ＜0.05）；給藥17 天，21 天，ROS 各劑量組均出現明顯的足趾腫脹抑制作用（P ＜0.05）（表2、表3）。

表3 對AA大鼠AI的影響（xˉ±s，n=10）

2.3 對AA血清中中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響

與空白組相比較，模型組血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 含量均顯著高于空白組（P ＜0.01，P ＜0.05）；與模型組相比，ROS 高、中、低劑量組均能顯著降低血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 含量（P ＜0.01，P＜0.05）（表4）。

表4 對AA大鼠血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響（xˉ±s，n=10）

表5 對AA大鼠炎性組織液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響（xˉ±s，n=10）

2.4 對AA大鼠組織液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響

與空白組相比較，模型組血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量明顯高于空白組（P ＜0.01）；與模型組相比，ROS 高、中、低劑量組均能顯著抑制組織液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 含量（P ＜0.01，P ＜0.05）（表5）。

3 討論

完全弗氏佐劑性類風濕性關節炎T細胞依賴性的AA模型，其原理為BCG作為抗原進入機體使T細胞致敏（急性反應炎癥），當再次接觸抗原，致使T細胞分化增值，釋放各種淋巴因子以及直接殺傷靶細胞，引起單核細胞浸潤，同時由抗原抗體形成的免疫復合物激活補體，導致白細胞趨化激活，釋放一系列致炎因子產生局部和全身性炎性反應（繼發反應）。病理主要表現為關節原發性和繼發性病變，關節紅腫脹痛，關節滑膜組織增生，炎性細胞浸潤，血管翳生成，與人類的類風濕性關節炎特征極為相似，是篩選和研究治療人類類風濕性關節炎的理想模型[8]。

PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 等細胞因子在類風濕性關節炎患者中，起到十分重要的作用。這類細胞因子的升高與滑膜組炎性反應和超長增生，關節變形有著密切的關系。IL-1、PGE2在類風濕性關節炎中是一種重要的炎性介質，參與類風濕性關節炎FLSs（類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞）的激活作用，是金屬蛋白酶的關鍵介質，參與對關節的骨和軟骨的侵蝕[9,10]。IL-6 是一種多效性前炎癥因子，有多種生物活性，可以促進自身的免疫現象，使急性炎癥轉化為慢性炎癥狀態，造成系統炎癥，破壞軟骨，骨侵蝕，滑膜增生[11-14]。TNF-α主要由單核巨噬細胞產生，是類風濕性關節炎發生、發展過程中的特征性細胞因子，其高水平的分泌可刺激滑膜細胞和軟骨細胞產生PGE2和膠原酶，引起骨和和軟骨吸收的破壞，造成纖維細胞的增生，在類風濕性關節炎的病理過程中起到關鍵作用[15,16]。RF是抗人或動物免疫球蛋白IgG 和Fc 段的抗體，多以IgM 型為主，它廣泛存在于患者血清或以免疫復合物形式沉積于關節滑膜，繼而激活補體，引起慢性漸進性免疫炎癥損傷，從而誘導類風濕關節炎的發生，是作為類風濕性關節炎分類診斷中的重要指標，具有提高類風濕性關節炎的診斷效率和敏感性、特異性，減少誤診和漏診的發生，對于類風濕性關節炎的發展具有重要意義[17-21]。

本研究表明，風濕骨痛噴霧劑能夠顯著抑制AA大鼠足腫脹度，降低AI 指數，證明了其良好的抗類風濕關節炎的效果。其作用機制可能是通過抑制T淋巴細胞的增殖，抑制PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 分泌，阻止細胞因子的炎性進程，達到抗類風濕性關節炎的作用。