桂枝茯苓膠囊對實驗性子宮內膜異位癥痛經作用及機制＊

孫 蘭，李家春，宗紹波，呂耀中，王振中＊＊

（1.江蘇省食品藥品職業技術學院 淮安 223003；2.江蘇財經職業技術學院 淮安 223003；3.江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；4.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）是育齡期女性的常見疾病，主要表現為子宮內膜間質和腺體在子宮腔以外的部位生長，其臨床癥狀主要表現為痛經、不孕、月經不調、盆腔包塊等，其發病率約占育齡期婦女的15%左右[1]。痛經是子宮內膜異位癥患者的主要癥狀，據統計EM 患者87.7%有痛經癥狀，嚴重影響患者的生活質量，但其發生機制尚不明確[2]。有研究表明瞬時受體電位辣椒素亞型l(Transient Receptor Potential Vanilloid Receptor 1，TRPV1)與子宮內膜異位癥疼痛相關，子宮內膜異位組織TRPV1 蛋白表達顯著升高[3]。TRPVl受到多種炎癥介質的調節，如神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、緩激肽(bradykinin，BK)、前列腺素(prostaglandin，PG)[4]等。

桂枝茯苓丸出自東漢著名醫學家張仲景的《金匱要略》，在臨床使用了近兩千年，其處方由五味藥材組成，即桂枝、牡丹皮、茯苓、桃仁、芍藥。以桂枝茯苓丸為基礎，通過工藝改進、質量標準提高研制成現代中藥制劑桂枝茯苓膠囊，桂枝茯苓膠囊具有活血、化瘀、消癥等功效，臨床上用其治療痛經、子宮肌瘤、盆腔炎性后遺癥、子宮內膜異位癥等婦科血瘀性疾病具有確切療效。研究表明桂枝茯苓膠囊對子宮本實驗通過復制大鼠子宮內膜異位癥痛經模型[5,6]，探討桂枝茯苓膠囊治療子宮內膜異位癥疼痛機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

桂枝茯苓膠囊，由江蘇康緣藥業股份有限公司提供，批號：1700425，規格：0.31 g·粒-1；散結鎮痛膠囊，江蘇康緣藥業股份有限公司，規格：0.4 g·粒-1，批號：170216；苯甲酸雌二醇注射液，寧波第二激素廠，批號：20170212，規格：2 mL：4 mg；縮宮素注射液，寧波第二激素廠，規格：2 mL：20 IU，批號：170118；Anti-NGF 抗體，Abcam，ab52918；Anti-VR1 抗體，Abcam，ab74855；MaxVision TM 免疫組化檢測試劑盒，福建邁新生物技術有限公司；PBS 緩沖液：自行配制，每升中含8 g Na-Cl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH 調至7.4。

1.2 動物

SD大鼠，SPF級，雌性，180-200 g，雌性，由維通利華提供，許可證號：SCXK（蘇）2016-0003。動物分籠飼養，自由飲水和攝食，飼養室溫度20-25℃，相對濕度為40-65%，適應性飼養3天后開始實驗。

1.3 儀器

電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；電子數顯游標卡尺，德國美耐特；DX45奧林帕斯顯微鏡，日本生產；櫻花全自動真空組織脫水機；Thermo 包埋機，型號Histostar；Thermo 手動切片機，型號：Finesse E+；Shandon全自動染色機；OLYMPUS顯微鏡BX41。

2 方法

2.1 分組、模型復制及給藥

80只SD大鼠，隨機選取10只作為假手術組，其余70 只大鼠用于子宮內膜異位癥模型復制。大鼠稱重后，10%水合氯醛3.5 mL·kg-1，腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，用一次性備皮刀逆被毛方向剃毛，仰臥位固定，絡合碘常規消毒皮膚后，鋪巾于下腹正中靠左上方做長1 cm 切口，進腹后在膀膚背側找到子宮，挑出左側子宮角，近端離左子宮角1 cm 處結扎，遠端離卵巢1 cm處結扎并切下左側部分子宮，將切下的子宮組織放在盛有PBS液體的培養皿中，縱行解剖開子宮段，剪取5 mm×5 mm 的子宮內膜組織（含子宮肌層）一塊。取子宮內膜組織一塊，內膜面貼于種植部位用6-0 絲線對角縫合固定于右側前腹壁內側腹膜，絡合碘稀釋液沖洗盆腔，4-0 絲線常規縫合關腹。術后注意保暖。麻醉蘇醒后正常喂養。假手術組：手術步驟同實驗組，僅切去部分子宮后，不植入子宮內膜，替代以6-0絲線在右側前腹壁內側腹膜上縫合2針。手術后，連續注射青霉素3天，40萬單位·每鼠-1。術后2天，大鼠每4天皮下注射雌二醇0.1 mg·kg-1·天-1，總共三次，可以促進增長異位子宮內膜。

28天恢復期后，70只子宮內膜異位癥大鼠麻醉開腹觀察紅色/棕色顏色和囊性植入物表面形成，這是模型成功標志。測量植入子宮內膜的體積，以確保所有的大鼠表現出類似的異位病灶的大小。選擇50只，分為模型組、散結鎮痛膠囊組（0.47 g·kg-1）、桂枝茯苓膠囊三個劑量組（0.54 g·kg-1、0.27 g·kg-1、0.14 g·kg-1）。各組灌胃給藥，假手術組和模型組灌胃等體積0.5%CMC-Na 混懸液，給藥體積10 mL·kg-1。連續4 周，每天1次。給藥第4周，假手術組大鼠背部皮下注射生理鹽水，其余組動物注射雌激素0.05 mL·0.1 mg-1·只-1，連續7天。末次灌胃1 h后，各鼠腹部注射縮宮素注射液1.0 mL·10 IU-1·只-1。觀察大鼠并記錄30 min 內大鼠扭體次數。根據公式計算扭體次數抑制率（%）（抑制率%=（模型組扭體次數-給藥組扭體次數/模型組扭體次數）×100%）。

2.2 觀察指標

2.2.1 異位組織體積

扭體觀察結束后，10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)腹腔麻醉，逐層打開腹腔，觀察異位灶形態并用數顯游標卡尺測量移植物長、寬、高（mm），計算異位組織體積(異位組織體積=0.52×長×寬×高，mm3)。

2.2.2 異位組織病理觀察

測量體積后，迅速取出大鼠異位灶組織，立即置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，常規HE 染色，鏡下觀察異位灶的組織形態學特點。病理專業人員閱片，根據病變輕重程度，依次半定量為輕度：“+”，中度“++”，重度“+++”，無病變組織標記為“-”。

2.2.3 免疫組化法檢測NGF、TRPV1蛋白表達

異位灶組織經4%多聚甲醛固定后，常規脫水，石蠟包埋，石蠟切片常規脫蠟至水。

PBS 洗3 次，每遍5 min。用PBS 配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水洗1次；抗原修復，PBS洗5 min，甩去多余液體滴加一抗4℃過夜（NGF稀釋度為1∶250；TRPV1 稀釋度為1∶1000，過夜后在37℃復溫45 min），PBS洗3次各5 min，甩去PBS液，每張切片加1滴50 μl MaxVision TM試劑，室溫下孵育15 min，PBS洗3次各5 min，每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1 min，陽性顯色為棕色，蒸餾水洗終止染色，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍，采用不同濃度酒精脫水，最后透明及封片，每張切片觀察5 個高倍視野，用分析軟件（Image Pro Plus 5.0.2）測定光密度值。

2.3 結果統計處理

采用Graphpad Prism5.0（GPW5-384305-RAG-5235）軟件處理數據，以均數±方差（±SD）表示結果。

3 結果

3.1 GZFLC 對子宮內膜異位癥模型大鼠疼痛反應的影響

結果表明，與模型組相比，散結鎮痛膠囊組大鼠扭體次數明顯減少（P ＜0.01），其抑制率為51.1%，GZFLC 三個劑量組均能顯著減少大鼠扭體次數（P ＜0.01），其抑制率分別為63.2%、60.4%、47.1%（表1）。

3.2 GZFLC對大鼠移植物體積的影響

與模型組比較，散結鎮痛膠囊組和GZFLC 高、中、低劑量組大鼠移植物體積顯著減少（P ＜0.01），其抑制率分別為61.9%、66.0%、59.1%、56.6%。（表2）

3.3 GZFLC對大鼠子宮內膜異位組織病理的影響

結果表明，模型組子宮內膜上皮細胞明顯增生，腺體數量減少，間質內毛細血管明顯增生，大量炎性細胞浸潤。散結鎮痛膠囊組異位的子宮內膜呈萎縮性改變，腺體腺腔變小，甚至呈縫隙狀，間質內毛細血管輕度增生，少量炎性細胞浸潤，與模型組比較有統計學顯著性差異（P ＜0.05）；桂枝茯苓膠囊各劑量組異位的子宮內膜呈萎縮性改變，腺體腺腔變小，甚至呈縫隙狀，炎性細胞浸潤減少，間質內毛細血管增生減輕，與模型組比較有明顯改善作用（P ＜0.05）（表3，圖1）。

3.4 GZFLC 對子宮內膜異位癥痛經大鼠子宮內膜異位組織NGF、TRPV1表達的影響

結果表明，模型組棕黃色面増多，提示NGF、TRPV1 表達明顯，與模型組比較，GZFLC 高、中、低劑量組棕黃色區域減少，GZFLC 顯著降低大鼠子宮內膜異位組織NGF、TRPV1蛋白表達（P ＜0.01，P ＜0.05）（表4，圖2，3）。

4 討論

子宮內膜異位癥是育齡婦女的多發病，近年發病率呈明顯上升趨勢，子宮內膜異位癥的臨床表現包括疼痛、不育和盆腔包塊、其中疼痛是最困擾患者的癥狀[7]，約70%-80%患者有不同程度的疼痛，包括痛經、慢性盆腔痛、性交痛和大便痛，嚴重影響患者的身心健康，痛經是困擾內異癥患者主要原因之一，緩解痛經是臨床治療內異癥的主要目的之一[8]。子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，高水平雌激素不僅能促使子宮內膜生長，還能引起一系列內環境紊亂從而引起痛經[9]，其機制可能是增高的雌激素刺激前列腺素的產生參與內異癥疼痛的發生[10]。目前自體移植法是復制子宮內膜異位癥模型常用方法[11,12]，在自體移植手術的基礎上，采用雌激素及縮宮素誘導痛經模型是研究子宮內膜異位癥疼痛發病機制的常用方法[5,6]。

表1 GZFLC對子宮內膜異位癥模型大鼠疼痛反應的影響（Xˉ±SD,n=10）

表2 GZFLC對子宮內膜異位癥痛經大鼠移植物體積的影響（Xˉ±SD,n=6）

表3 GZFLC對大鼠子宮內膜異位組織病理評分的影響（Xˉ±SD,n=6）

表4 GZFLC對子宮內膜異位癥痛經大鼠子宮內膜異位組織NGF、TRPV1蛋白表達的影響（Xˉ±SD,n=3）

圖1 GZFLC對大鼠子宮內膜異位組織病理評分的影響(HE，×200)

圖2 GZFLC對子宮內膜異位癥痛經大鼠子宮內膜異位組織TRPV1蛋白表達的影響(SP，×200)

圖3 GZFLC對子宮內膜異位癥痛經大鼠子宮內膜異位組織TRPV1蛋白表達的影響(IHC，×200)

TRPV1主要分布于傷害性感覺神經元，TRPV1通道被激活后能使感覺神經末梢痛覺敏感性增加，同時對疼痛的持續存在產生作用[13]。研究結果顯示TRPV1在外周神經組織及非神經組織均有表達，如膀胱、胃腸道、平滑肌細胞等[14-16]。通道在炎性和神經病理性狀態下有著非常重要的作用，研究發現某些內臟疼痛的疾病TRPV1 表達增多，如腸易激綜合征、子宮內膜異位癥等[17,18]。TRPV1在介導炎性痛、神經性疼痛及內臟痛等疾病受到致敏因子NGF、BK、PG 等的調節[4]。疼痛必須通過神經來感知，研究表明，子宮內膜異位癥患者異位病灶均有NGF的高表達，且與患者疼痛癥狀的嚴重程度有關[19]。研究表明NGF 能夠增加TRPV1 的表達[20]。

GZFLC 方中桂枝味辛甘而性溫，入氣入血以溫通經脈而行瘀滯，桃仁為化瘀消癥之要藥，牡丹皮能散血行瘀，白芍有活血養血止痛功效，茯苓甘淡，消痰利水，滲濕健脾，以助消癥之力。本研究結果表明，GZFLC能明顯抑制子宮內膜異位癥痛經大鼠扭體反應，并能顯著減小子宮內膜異位組織體積，GZFLC 治療后使異位的子宮內膜呈萎縮性改變，對NGF、TRPV1 的蛋白表達均有抑制作用。提示GZFLC 可能通過抑制TRPV1及NGF的表達，從而緩解子宮內膜異位癥疼痛的發生。