葛根素改善3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取和胰島素抵抗＊

楊維波，韓福祥，劉振明，董紅昌，張建華

（1.山東省陽信縣中醫(yī)醫(yī)院 陽信 251800；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 北京 100034）

隨著居民生活方式改變和老齡化進程的加速，我國糖尿病的患病率正在迅速增長，2002年糖尿病的患病率為2.7%[1]，2007 年增長到9.7%[2]，2010 年一項涵蓋全國31個省市自治區(qū)的9.8萬18歲以上的人群調(diào)查顯示，我國成人糖尿病患病率已上升到11.6%,糖尿病前期患病率為50.1%[3]，糖尿病已經(jīng)成為繼心腦血管、腫瘤后又一個嚴(yán)重危害人民健康的重要慢性非傳染性疾病。糖尿病的主要類型是2 型糖尿病，其主要病理生理機制為胰島β細(xì)胞功能受損造成的胰島素分泌不足和胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）。

在祖國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，糖尿病典型的臨床癥狀屬于“消渴病”的范疇，幾千年來，中藥在治療“消渴病”的方面積累了很多寶貴經(jīng)驗。近些年來，從中藥中提純的藥物有效成分應(yīng)用于臨床，在治療糖尿病方面發(fā)揮了不可替代的作用，葛根素是中藥葛根中活性物質(zhì)異黃酮類物質(zhì)的主要成分[4]，在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)其有改善2型糖尿病患者糖代謝的作用。本實驗旨在觀察葛根素對3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取及對IR 的影響，探討其作用機制，為臨床上治療糖尿病提供新的思路。

表1 Real-time PCR引物序列

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX，美國Sigrna 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；抗體GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ（Santa Cruz 公司）；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Fermentas 公司）；引物和內(nèi)參GAPDH（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；Rotor-Gene熒光定量PCR儀（Corbett Research 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）；高速臺式冷凍離心機（Thermo Fisher）。

1.2 實驗方法

1.2.1 3T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，傳至第三代細(xì)胞狀態(tài)良好時，加人含0.5 mmol?L-1IBMX、10-6mol?L-1胰島素、1 μmmol?L-1地塞米松、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，換為含10 ug?mL-1胰島素的培養(yǎng)基48 h，最后在10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)分化9天的3T3-L1細(xì)胞經(jīng)油紅O染色鑒定，90%以上呈脂肪細(xì)胞表型用于試驗。

1.2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型建立

參照文獻報道方法[5]3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟后，給予1 μmmol?L-1地塞米松在10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，以葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法分別在48、72、96、120 h測每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，與未接種細(xì)胞的空白孔葡萄糖相減，計算葡萄糖消耗量，當(dāng)兩組間葡萄糖的消耗量差異有統(tǒng)計學(xué)意義時（P ＜0.05），為造模成功。葡萄糖消耗差值比例最大的時間點作為建立胰島素抵抗模型最佳作用時間。

1.2.3 細(xì)胞分組

取誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，將其分為空白組、模型組、葛根素10 mg?L-1組、葛根素100 mg?L-1組和葛根素200 mg?L-1組。其中空白組不建模型，以含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組為建立模型但不加藥物干預(yù)；其它3 組為建立模型后分別用不同濃度的葛根素干預(yù)。

1.2.4 檢測培養(yǎng)基上清中葡萄糖濃度及細(xì)胞活力測定

確定造模成功后，在葛根素干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入葛根素液180 μL,使其終濃度分別為10、100、200 mg?L-1，空白組、模型組加入等體積的培養(yǎng)液，共同孵育24 h。分別取每組的上清液1 mL 置于Eppendorf管中,高速離心,按葡萄糖測定試劑盒的操作說明書,用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測各組培養(yǎng)基上清中葡萄糖OD值。

各組按5x104/孔接種于96 孔,每孔加入20 μLMTT（5 g·L-1），孵育4 h,吸去上清，加入DMSO溶液150 μL/孔，震蕩10 min 充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測OD 值，波長570 nm，以此代表細(xì)胞活力。

1.2.5 3T3-L1脂肪細(xì)胞RNA提取及Real time PCR分析

用1 mL TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，設(shè)計GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ mRNA 和3-磷酸甘油醛脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）引物（表1），按照Real time PCR 試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR反應(yīng)條件為95℃變性15 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，共45個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real-Time PCR 的擴增曲線和溶解曲線，以GAPDH 為內(nèi)參，計算mRNA 相對表達量，進行均一化處理后，再進行統(tǒng)計分析，引物序列（表1）。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達

用含1%PMSF 的RIPA 裂解細(xì)胞，離心取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度，取20 μL蛋白樣品，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白，結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫下封閉1 h 后，加入一抗，4℃孵育過夜后，PBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫輕搖1 h；用ECL法成像。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 地塞米松作用后不同時間細(xì)胞培養(yǎng)基上清葡萄糖濃度

脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟后，給予地塞米松作用，分別測48、72、96、120 h空白組及模型組細(xì)胞培養(yǎng)基上清葡萄糖濃度，用模型組葡萄糖濃度與空白組葡萄糖濃度的差值反映細(xì)胞IR程度。結(jié)果顯示，各點模型組葡萄糖濃度高于空白組（P ＜0.01），提示48 h后可構(gòu)建穩(wěn)定的胰島素抵抗模型；96 h 時差值顯著高于其它時間組，證實96 h時IR達最佳（表2）。

2.2 葛根素作用于胰島素抵抗細(xì)胞后葡萄糖濃度測定

3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型誘導(dǎo)成功后，加入不同濃度的葛根素共同培養(yǎng)，測得各組細(xì)胞培養(yǎng)上清葡萄糖含量（表3）。與空白組比較，模型組培養(yǎng)基上清葡萄糖OD 值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；葛根素干預(yù)后，模型組細(xì)胞葡萄糖利用增加，葡萄糖OD 值與模型組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。葛根素100 mg?L-1組和葛根素200 mg?L-1組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.3 葛根素對脂肪細(xì)胞活力及分化的影響

MTT 結(jié)果顯示，各組吸光度值與空白組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），提示各濃度的葛根素對3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖活力無影響（表4）。

2.4 各組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ mRNA Real-Time PCR結(jié)果比較

結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ mRNA 水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，葛根素10 mg?L-1、葛根素100 mg?L-1、葛根素200 mg?L-1組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ mRNA 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；葛根素200 mg?L-1組與葛根素100 mg?L-1組比較GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ mRNA水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）（表5）。

表2 地塞米松作用后不同時間細(xì)胞上清葡萄糖濃度（OD）值

表3 不同濃度葛根素對細(xì)胞培養(yǎng)上清葡萄糖濃度的影響（OD值）

表4 不同濃度葛根素對細(xì)胞增殖的影響（OD值）

2.5 Western blot 法 檢 測 各 組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ蛋白表達

結(jié)果比較顯示，與空白組比較，模型組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，葛根素10 mg?L-1、葛根素100 mg?L-1、葛根素200 mg?L-1組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），葛根素200 mg?L-1組與葛根素100 mg?L-1組比較，GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表6，圖1）。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，脾胃為后天之本，氣血生化之源，飲食通過胃的受納腐熟、脾的運化升清化生水谷精微，內(nèi)養(yǎng)五臟六腑，外養(yǎng)四肢百骸、皮毛筋骨，如飲食不節(jié)、過食肥甘醇酒厚味、安逸少動，可損傷脾胃功能；脾失健運，脾不能升清、胃不降濁，氣機不暢，不能散精上輸于肺，肺失津液則化燥，故口渴多飲，虛火內(nèi)生，則消谷善饑。明代趙獻可《醫(yī)貫·消渴論》云:“脾胃既虛，則不能敷布津液故渴”，可見，糖尿病的發(fā)生于脾胃功能關(guān)系密切。

表5 各組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ mRNA Real-Time PCR結(jié)果比較

表6 各組GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPARγ蛋白表達結(jié)果（蛋白灰度值）比較

圖1 Western blot法檢測各組蛋白表達

葛根為豆科植物野葛的干燥根，是調(diào)理脾胃功能的傳統(tǒng)中藥，其性味甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉之功效[6]，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載葛根“主消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒，葛谷，主下利”提示葛根有治療“消渴病”的作用。以葛根為主藥，配伍黃芩、黃連、甘草組成葛根芩連湯，臨床上可用于治療肥胖型2型糖尿病胃腸濕熱證。有研究顯示[7]，葛根芩連湯激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator- activated receptor gamma,PPARγ），從而上調(diào)脂聯(lián)素和細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter type 4,GLUT4）mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平，認(rèn)為葛根芩連湯有調(diào)節(jié)糖尿病大鼠模型糖代謝改善脂肪IR的作用。

葛根素是中藥葛根主要有效成分之一，近年來也有很多研究，楊蕾[8]等用葛根素對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠干預(yù)4 周后，發(fā)現(xiàn)葛根素降低了模型小鼠空腹葡萄糖。本實驗用不同濃度的葛根素干預(yù)3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型后，細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度均較模型組降低（P ＜0.01）；提示葛根素有改善3T3-L1細(xì)胞糖代謝的作用。

IR 是胰島素作用的靶器官、組織（如肝臟、肌肉、脂肪組織等）對胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低，是正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)[9]，是2型糖尿病的重要標(biāo)志。2型糖尿病IR主要體現(xiàn)在以下3 個水平[10]：（1）受體前水平，包括胰島素基因的異常、胰島素拮抗物質(zhì)影響、胰島素降解加速等；（2）受體水平，包括胰島素受體基因突變、胰島素絲氨酸/蘇氨酸磷酸化、胰島素受體抗體等；（3）受體后水平，包括胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖攝取的各個環(huán)節(jié)障礙，如葡萄糖轉(zhuǎn)運體合成和轉(zhuǎn)運障礙等，其中以GLUT4尤為重要。

GLUT4 是主要的葡萄糖運載體，分布于胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細(xì)胞，主要存在于細(xì)胞內(nèi)，而細(xì)胞膜上的量很少，在胰島素的刺激下細(xì)胞膜上的GLUT4大量增加而實現(xiàn)葡萄糖的運轉(zhuǎn)，胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)運是通過PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 所組成的異二聚體，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3個家族成員，具有磷脂酰肌醇激酶和Ser/Thr（絲氨酸/蘇氨酸）蛋白激酶的雙重活性[12]。調(diào)節(jié)亞基p85 包含1 個SH3 區(qū)域、2 個富含脯氨酸區(qū)域、2 個被一非編碼區(qū)分開的Src 同源結(jié)構(gòu)域（SH2）和p110 與p85 相互作用的非編碼區(qū)，其中2 個SH2 可與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，引起催化亞基的活化，從而傳導(dǎo)酪氨酸激酶信號[13]。研究表明[14]，如果采用基因敲除等技術(shù)，造成PI3K調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110的基因功能缺陷均可導(dǎo)致糖、脂代謝紊亂，說明PI3K對調(diào)節(jié)糖，脂代謝具有重要作用。

AKT 又稱蛋白激酶B（proteinkinaseB，PKB），為Ser/Thr 激酶，是PI3K 信號通路下游的重要靶蛋白，目前發(fā)現(xiàn)AKT有3個亞型，由不同基因編碼，具有80%的同源性，分布于不同組織。AKT 由N 端PH 結(jié)構(gòu)域、中間催化域和C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組成，PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，中間催化域可催化Ser/Thr 殘基磷酸化，C 端調(diào)節(jié)域含有磷酸化位點Ser473，此位點是AKT完全活化所必需的[15,16]。

當(dāng)細(xì)胞外胰島素與細(xì)胞膜胰島素受體結(jié)合，引起酪氨酸蛋白激酶活化時，后者又使胰島素受體底物發(fā)生磷酸化并與PI3K 調(diào)節(jié)亞基p85 的SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，招募并激活催化亞基p110，從而催化質(zhì)膜上磷脂酰肌醇磷酸化，與AKT 的PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合并定位于磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 附近，活化的AKT 從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核內(nèi)，促使GLUT4 囊泡前移與細(xì)胞膜融合，介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運入細(xì)胞，增加葡萄糖攝取[17]；激活PI3K和AKT分子，可啟動整個PI3K/AKT 信號通路的傳導(dǎo)，增加GLUT4轉(zhuǎn)運，調(diào)控血糖，減少肝糖原的合成，減輕胰島β細(xì)胞損傷[18]，如果胰島素受體后PI3K/AKT 信號通路障礙及下游靶蛋白功能異常均可引發(fā)糖、脂代謝障礙，繼而導(dǎo)致IR的發(fā)生。

本實驗結(jié)果顯示：地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型中GLUT4、P13K、AKT mRNA、蛋白表達較空白組下降，提示實驗細(xì)胞模型有明顯的糖代謝障礙和IR；加入葛根素處理后以上指標(biāo)明顯升高，呈劑量依賴性，但200 mg?L-1組與100 mg?L-1相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），推測葛根素能通過P13K/AKT信號途徑升高GLUT4表達，改善脂肪細(xì)胞IR。

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）途徑也是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，AMPK 是一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞機體能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白激酶，廣泛存在于肝臟、骨骼肌和脂肪組織中。AMPK 一種異源三聚體蛋白，由α、β、γ3 個亞單位組成，AMPK 在調(diào)節(jié)肌體能量代謝的平衡方面起總開關(guān)作用，其活性受AMP/ATP 比值調(diào)控，參與多種代謝過程，能調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝，運動、組織缺血、缺氧等，都可以激活A(yù)MPK通路，活化的AMPK使脂肪酸氧化作用、肝糖原的轉(zhuǎn)化、骨骼肌對葡萄糖的攝取增強，并通過誘導(dǎo)GLUT4 向質(zhì)膜轉(zhuǎn)移，并通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子開啟GLUT4基因的表達，增加脂肪組織中葡萄糖的利用，從而使得機體對葡萄糖的攝取增強[19,20]。

PPARγ是核受體過氧化物酶體增殖物激活受體的一個亞型，人體很多組織都能分泌PPARγ，但以脂肪組織最多，動物實驗表明，激活脂肪細(xì)胞中PPARγ，可誘導(dǎo)內(nèi)臟和皮下大脂肪細(xì)胞較少，小脂肪細(xì)胞數(shù)目增加，從而增加胰島素的敏感性[21]。PPARγ激活后，主要通過以下方式提高胰島素敏感性[22]，改善IR：①促進白色脂肪細(xì)胞分化，使其數(shù)量增多、體積減小，并增加胰島素受體的數(shù)目。抑制脂肪細(xì)胞的肥大和脂肪分解，誘導(dǎo)大脂肪細(xì)胞的凋亡；②調(diào)控脂肪細(xì)胞的分泌功能，增強脂聯(lián)素等細(xì)胞因子的合成；③促進與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄：通過上調(diào)PI3K 亞單位p85、CAP增加GLUT4的表達，進而促進胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；④激活A(yù)MPK,通過非胰島素依賴機制促進外周組織細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運，抑制糖誘導(dǎo)的胰島素釋放，以改善葡萄糖代謝和高胰島素血癥。本實驗檢測到地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型中AMPK、PPARγmRNA、蛋白表達較空白組下降，加入葛根素處理后明顯升高，推測葛根素改善脂肪細(xì)胞糖代謝和IR可能與AMPK、PPARγ升高有關(guān)。

研究顯示[23]，P13K/AKT 和AMPK 信號通路存在復(fù)雜的交互作用，一方面，AMPK 的激活可以促進P13K和AKT 等多種P13K/AKT 信號通路分子的活性增加，抑制胰島素受體底物-1 調(diào)控的負(fù)反饋回路,還可以通過調(diào)節(jié)PI3K 來激活A(yù)KT；PPARγ活化也能促進PI3K的亞單位P85 的表達,促進胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；另一方面，PI3K/AKT 能調(diào)節(jié)AMPK 活性，也可通過調(diào)節(jié)C/EBPα、PPARγ的表達，在3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要作用[24]。

肥胖可引起IR，進而引起糖尿病，目前的研究顯示隨著身體質(zhì)量指數(shù)和脂肪組織增加，糖尿病的發(fā)病率會升高[25]。脂肪組織是IR 發(fā)生的重要的靶組織，增加脂肪細(xì)胞的胰島素敏感度和葡萄糖攝取是治療2型糖尿病的手段之一。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是Swiss小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，能在誘導(dǎo)劑作用下分化為脂肪細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于糖、脂代謝相關(guān)的基礎(chǔ)和實驗研究。本實驗選擇用地塞米松誘導(dǎo)建立3T3-L1 脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，從細(xì)胞水平研究葛根素對IR 的作用機制，結(jié)果顯示，3T3-L1 脂肪細(xì)胞發(fā)生IR 后，葡萄糖攝取能力明顯下降，而葛根素能增加其對葡萄糖的攝取，改善IR，其機制可能與上調(diào)P13K、AKT、AMPK、PPARγ基因和蛋白表達有關(guān)。