基于實體語法系統研究中藥治療乳腺癌的分子調控網絡＊

雷巧靈，侯旭燦，賈聰敏，李 夢，王 耘

（北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488）

乳腺癌是中國常見女性惡性腫瘤之一，在中國每年被診斷為乳腺癌和死于乳腺癌的人數也在逐年增加[1]，闡明乳腺癌的分子生物學機制已成為重要的轉化醫學研究之一，但是乳腺癌的發病機制復雜，包括基因突變、遺傳因素、神經功能異常等[2]。很多研究認為基因突變是乳腺癌發生的主要特征[3]，基因的突變積累會進一步影響與乳腺癌發生發展密切相關的信號通路，包括原癌基因，抑癌基因以及與DNA 損傷與修復相關的基因。在乳腺癌的發生發展中，癌癥相關基因的關系組成一個復雜的相互調控的動態網絡過程[4]，分子調控網絡中每個基因或蛋白質的變化都可能會直接或者間接影響細胞周期，增殖和凋亡等生物學過程。隨著生物信息學的發展，積累了大量的基因或蛋白之間的相互調控數據，因此從疾病分子調控網絡角度對乳腺癌等復雜疾病進行分析有助于進一步闡明乳腺癌的發病機制。

相較于現代醫學，中藥治療乳腺癌具有一定優勢，但是中藥多成分，多靶點的特點，使其在治療乳腺癌等復雜疾病上存在作用機制不清楚等局限性，由于乳腺癌的發病機制也十分復雜，使中藥在治療乳腺癌的過程中所產生的具體作用更加難以明確。

本研究基于數據庫收集乳腺癌相關基因或蛋白質調控信息構建乳腺癌分子調控網絡，并利用本實驗室建立的實體語法系統[5-7]，結合乳腺癌分子調控網絡，化合物及靶點數據，分別構建黃芪、茯苓、白花蛇舌草以及柴胡治療乳腺癌的分子作用網絡圖，以推斷藥物作用靶點與疾病相關靶點之間的作用關系，從而對這4 味中藥進行作用機制研究，為中藥通過組分配伍的新藥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌分子調控網絡的構建及分析

DISNOR[8]是一個有關疾病基因調控網絡的數據庫，主要是利用DisGeNET 的基因-疾病關聯數據，SIGNOR 中標注的與疾病基因相關的交互作用信息和mentha 中蛋白相互作用數據生成疾病基因的調控網絡，目前該數據庫收集超過3 700 個疾病相關網絡。CIDeR[9]主要是從科學文獻中提取經過實驗驗證的疾病相關分子之間的相互作用信息的一個人工管理數據庫，目前該數據庫已通過檢索1 912個出版物，收集了18 813種疾病相關的相互作用關系。本研究通過檢索“乳腺癌”等關鍵詞，并使作用對象為基因或蛋白質，作用類型為抑制或激活，在DISNOR 和CIDeR 數據庫中分別收集了124 及674 條調控關系。匯集并去除重復關系獲得219個分子，403條調控關系，而后在PubMed文獻檢索驗證的基礎下，獲得包含228個分子及498條調控關系的乳腺癌分子調控網絡。

1.2 治療乳腺癌的中藥及活性成分篩選

中醫在臨床上治療乳腺癌常用扶正固本法、利水滲濕法、清熱解毒法以及疏肝理氣法的處方治法，其中治療乳腺癌的處方大部分采用四法聯用[13]。本研究按照中醫治療乳腺癌的四法治則，并基于臨床上常用中藥為標準，選擇了黃芪、茯苓、白花蛇舌草以及柴胡4味中藥。黃芪，臨床上用于補虛的代表藥，明《本草綱目》載有“為補者之長故名”。并且有研究發現黃芪注射液能有效阻滯乳腺癌MCF-7細胞的增殖[14]。茯苓屬于利水滲濕常用藥，桂枝茯苓丸為婦人癥瘕之專方，且茯苓酸能抑制MDA-MB-231 細胞的增殖并誘導其凋亡[15]。白花蛇舌草有清熱解毒的功效，有動物實驗證明白花蛇舌草的提取物能抑制乳腺癌的發展[16]。柴胡可疏肝解郁，中醫認為肝失疏泄為乳腺癌的主要病機，柴胡疏肝散是治療乳腺癌的常用方劑，且有研究證明柴胡疏肝散能顯著提高化療藥物對肺轉移乳腺癌的療效[17]。所以本研究最終選擇了這4種代表藥進行研究然后通過TcmSP數據庫[18]收集每一味中藥的化學成分。

獲得4 味中藥的全部化學成分后，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug-Like，DL）來篩選中藥的活性成分[19]。OB是表示到達體循環的口服施用劑量的未改變藥物的百分比，評價藥物能否發揮藥效的關鍵指標，DL代表中藥成分與已知西藥的相似性，用于估計預期化合物的“藥物樣”。本研究按TCMSP 建議的篩選標準以OB 的篩選標和DL 的篩選標準作為活性成分篩選條件。

1.3 中藥調控乳腺癌相關基因的解析

實體語法系統（entity grammar systems）是一種形式語法系統[6,7]，拓展于Chomsky生成語法系統，已利用其進行多項中藥作用機制的解析[5,20]，具有高效靈活等特點，適用于針對復雜生物系統的研究。

實體語法系統可以用G=(VN,VT,F,P,S)的數組形式表示，其中VN代表非末端字符集、VT為末端字符集、F 代表操作子集、P 和S 分別代表規則集和初始字符。在無需區別VN與VT時有V=VN∪VT。在本研究中V 代表網絡中各種類型的節點，包括中藥、中藥化學成分、化學成分作用靶點、疾病相關靶點等。F代表這些元素之間的關系，如interaction。P 類似于推理的公式，基于V 和F 所構成的結構單元實體進行推理，如實體1 為（A，B，interaction），實體2 為（B，C，interaction），那么可推出（A，C，interaction）。據此推斷A對C有間接調節作用，且A對C的作用距離為兩實體的作用距離之和。S 則對應于系統的初始狀態，本研究中的數據應用形式draw（A，B，C，D），可描述為源節點A 和靶點B 的作用方式為C（interaction），且作用距離為D 步，D 步為網絡中節點與節點之間關系推算的傳遞步數之和。

將篩選出的活性成分，通過STITCH數據庫[21]查找其作用靶點，并利用TTD 數據庫[22]收集乳腺癌相關靶點，以及基于數據庫所構建的乳腺癌分子調控網絡，利用實體語法系統構建中藥成分作用于乳腺癌相關靶點的分子作用網絡，通過推斷分子間相關作用，并利用DAVID對成分作用的疾病相關靶點進行富集分析，然后對所選中藥治療乳腺癌的作用機制進行解析并利用Cytoscape進行可視化。

2 結果與討論

2.1 乳腺癌分子調控網絡的構建及分析

我們利用數據庫及文獻檢索收集了228個基因或蛋白質及498個調控關系。其中發現有15個節點與主網絡無關聯，提示上述節點可能對整個網絡無影響，故剔除。最終構建包含213個節點，486條關系的調控網絡（圖1）。

網絡涉及多種信號通路，如TP53信號通路、PI3KAKT 信號通路、ATR/ATM 信號通路、WNT 信號通路、TNF 信號通路、mTOR 信號通路以及MAPK 信號通路，這些信號通路在腫瘤的發生發展中扮演重要的角色，如DNA損傷可導致腫瘤的生長[23]，DNA損傷的反應機制包括P53 腫瘤抑制因子及ATR/ATM，P53 可通過對Bax與Fas的轉錄激活，Bcl2的表達抑制來促進細胞凋亡[24-27]。ATR/ATM 信號通路在決定細胞對DNA 損傷信號的反應中起著關鍵作用，如ATR識別DNA損傷所引起的DNA 單鏈斷裂，并激活CHEK1 以啟動細胞周期停滯和DNA 復制抑制，抑制細胞周期蛋白[28]。而ATM-CHEK2 則是被DNA 雙鏈所激活，從而使細胞周期停滯[29]。另一方面PI3K/AKT，TGF-beta和TNF-alpha信號通路與細胞的生長或死亡相關。TGF-beta 以抗增殖作用而聞名，在很多晚期腫瘤中，TGF-beta 信號從抑制細胞增殖轉向激活細胞程序，這種變化被稱為上皮-間充質轉化（EMT），一旦發生這種轉變，就會賦予惡性腫瘤有關的癌細胞特征[30]。PI3K/AKT/mTOR信號通路則是通過生存信號的刺激來阻斷細胞凋亡，當生存信號不足，PI3K 信號通路下調，即可誘導細胞凋亡[31]。Wnt 通路調控細胞的粘附和遷移[32]。所構建的乳腺癌分子調控網絡包括核心信號網絡，因此足夠用于研究復雜的生物過程。

2.2 中藥及活性成分篩選

筆者對4味中藥及通過口服生物利用度及類藥性進行篩選的活性成分進行了統計（表1）。由結果可得通過篩選，黃芪所得活性成分有20種，茯苓為15種、白花蛇舌草為7種、柴胡有17種，其中黃芪、白花蛇舌草、柴胡共有的抗腫瘤成分為槲皮素，山奈酚等，茯苓的抗腫瘤成分為茯苓酸等。

2.3 中藥調控乳腺癌相關基因解析

2.3.1 4 味中藥有效成分作用靶點與乳腺癌相關基因的作用關系網絡

本研究利用實體語法系統對所篩選出的活性成分進行作用機理解析。從中藥化學成分對乳腺癌相關基因作用的角度分析這些中藥治療乳腺癌的方式。篩選的中藥化學成分對乳腺癌相關基因的分子作用網絡圖（圖2），其中A、B、C、D 分別是黃芪、茯苓、白花蛇舌草以及柴胡中的活性成分通過一步或多步對乳腺癌相關基因的調控。其中不同的節點形狀代表不同的類型。

圖1 乳腺癌分子調控網絡圖

表1 中藥及活性成分統計表

分析結果可知，黃芪中有16個成分經過多步作用最終作用于15 個乳腺癌相關靶點，其中ESR1、AR、PGR、CA2、HSP90AA1、PIK3CG、KDR、INSR、BCL2、PLAU、EGFR 為黃芪中化學成分的直接作用靶點。茯苓所含的13個化學成分會作用于乳腺癌相關靶點，其中AR、PGR、ESR1、CA2 為直接作用靶點。白花蛇舌草中6個化學成分經過多步作用最終作用于14個乳腺癌相關靶點，其中AR、PGR、ESR1、CA2、HSP90AA1、PIK3CG、PLAU、EGFR、INSR、BCL2 為直接作用靶點。柴胡中所含的13 個化學成分經過多步作用最終作用于14 個乳腺癌相關靶點，而AR、PGR、ESR1、CA2、HSP90AA1、PIK3CG、PLAU、EGFR、INSR、BCL2為直接作用靶點。4 味中藥作用最終作用于乳腺癌相關靶點結果如表2 所示，表中所標記靶點為中藥直接作用靶點。

由此結果可知4味中藥聯合使用則最終都會作用于ESR1、AR、BCL2、PGR、ERBB2、SRC、PIK3CA、CA2、EGFR、HSP90AA1、PIK3CG、KDR、INSR、PLAU、TFF1 15 個乳腺癌相關靶點。對這些疾病靶點進行富集分析表3所示，基因富集到“示，基因富信號通路”、“信號轉導”以及“細胞增殖的正調節”、“細胞遷移的正調節”等與腫瘤發生發展有密切關系的功能，也可以得知這4 味中藥是通過多種化學成分經過多靶點、多途徑最終作用于多個疾病靶點來達到治療乳腺癌的目的。

2.3.2 4味中藥作用于乳腺癌子網絡分析

由于整體網絡較為復雜，因此文章將通過提取子網絡的方法對藥物成分作用靶點與疾病靶點間的關系進行解析。由于黃芪、白花蛇舌草以及柴胡都含有槲皮素這一成分，黃芪和柴胡都含有山奈酚，且這兩成分都被證明具有抗腫瘤作用[33,34]，茯苓中的茯苓酸被證明有抗腫瘤的作用[15]，故對槲皮素、山奈酚、以及茯苓酸治療乳腺癌的作用機制進行解析，所提取的槲皮素、山奈酚、茯苓酸通過疾病靶點作用于乳腺癌的通路（圖3A、圖3B、圖3C）。

PTGS2 編碼COX-2 酶，其參與癌癥的發生，抑制免疫應答以及細胞凋亡，可能促進血管生成和腫瘤細胞侵襲和轉移，缺氧或者炎癥因子等因素會促進PTGS2的表達[35]。TNF，即腫瘤壞死因子，是一種多功能促炎細胞因子，在乳腺癌中高表達，并且參與多種生物過程的調控，包括細胞增殖，凋亡以及脂質代謝等。炎癥在乳腺癌發病機理中起主要作用，有研究證明腫瘤壞死因子的腫瘤促進功能可能是其具有誘導促血管生成，細胞黏附分子的表達以及誘導DNA 損傷的能力[36]。EGFR，是著名的乳腺癌分子靶標，EGFR 在大部分三陰性乳腺癌和炎性乳腺癌中都過度表達，有研究證明EGFR 的過表達可促進上皮-間質轉化（EMT）[37]。AKT1，也稱為蛋白激酶B（PKB），在人類癌癥中經常過度表達，是PI3K 下游的主要效應分子，其參與細胞內的代謝，生存和生長等多種生物學過程。AKT1在乳腺癌進展中的特異性作用主要分為兩方面：一是有研究證明下調AKT1的表達能明顯促進腫瘤細胞的遷移能力，二是抑制AKT1 的表達能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖[38,39]。

圖2 中藥成分調節乳腺癌相關靶點的生物分子作用網絡

表2 四味中藥作用于乳腺癌相關靶點

槲皮素對TNF、PTGS2、EGFR 均有負向調控作用[40-42]，而TNF被證實有促進AKT1表達的作用[43]，在乳腺癌腫瘤相關巨噬細胞中COX-2 的過表達會促進PI3K/Akt 通路的激活[44]。mTOR是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其位于PI3K 和Akt 的下游，PI3K/AKT/mTOR 信號通路是腫瘤進展的關鍵介質，當PI3K信號傳導激活AKT 則會導致mTOR 的活化[45]。而PPP2CA 則是編碼磷酸酶2A 催化亞基。其參與了細胞生長和分裂的負調控。大量研究強調了PP2A 作為腫瘤抑制因子的作用，并提示PP2A失活可能有助于癌癥的發展，活化的mTOR可使PP2A磷酸化并抑制其活性[46]。SRC是一種非受體酪氨酸激酶，定位于細胞的細胞內膜，被發現在乳腺癌等許多人類腫瘤中過表達，Src的過度表達在調節腫瘤血管生成、細胞增殖、遷移及侵襲等方面起重要作用，EGFR可通過磷酸化激活SRC[47]，而PP2A可以抑制SRC的活性[48]。

表3 疾病靶點富集分析結果圖

綜上所述，槲皮素具有的抗腫瘤作用一方面可通過抑制PTGS2 或TNF，再經由AKT-mTOR-PP2A 途徑達到抑制乳腺癌靶點SRC 的目的，另一方面槲皮素可抑制EGFR的活性，從而減弱促進SRC表達的能力。

山奈酚對Bcl-2、GSK3B 以及TNF 具有抑制作用[34,49,50]，GSK3B（糖原合成激酶3β），對多種惡性腫瘤的發生、增殖、凋亡等方面起到調控作用[51]。PTEN 是生長因子信號傳導的關鍵調節因子，而且PTEN 的丟失被證明與乳腺癌有關，另外PTEN 的腫瘤抑制功能獨立于磷酸肌醇脂質磷酸酶活性并在細胞周期調節，維持基因組不穩定性和控制DNA 修復機制中起關鍵作用，其保護細胞免于基因突變的累積和不受控制的增殖，PTEN 喪失使這些基因組保護機制失調，并且還導致AKT1活化，促進腫瘤發生[52]。GSK3B通過磷酸化PTEN的Ser-362和Thr-366位點而使其磷酸酶活性降低[53]。BCL2 編碼Bcl-2，在Bcl-2 家族起抗調亡作用，Bcl-2在乳腺癌中過表達，屬于癌基因，其表達的上調是生長因子促進細胞存活的關鍵機制[54]。目前有針對靶向抑制抗凋亡Bcl-2 的藥物，或者是將其與化合療法聯用以增加對腫瘤細胞的殺傷力。另外Akt可以通過磷酸化失活Bad 和通過轉錄激活上調Bcl-2 來促進細胞存活[55]。

所以，根據對山奈酚作用于乳腺癌相關靶點Bcl-2的解析可知，一方面通過抑制TNF 及GSK3B，再經由PTEN/AKT1 達到弱化Bcl-2 活性的目的，另一方面山奈酚有直接抑制Bcl-2的作用，通過以上途徑，山奈酚抑制了Bcl-2的表達，以促進乳腺癌細胞凋亡。

圖3 槲皮素（A）、山奈酚（B）、茯苓酸（C）通過疾病靶點作用于乳腺癌的通路圖

茯苓酸具有的抗腫瘤作用，表現為直接作用于乳腺癌相關靶點AR 而達到治療乳腺癌的目的。而AR是一種新興的乳腺癌激素靶點，AR 在60-70%的乳腺腫瘤中表達，有研究證明有大量的ER-/HER2+乳腺腫瘤表達AR，進而刺激腫瘤細胞的生長，而在此類細胞中，針對ER信號通路的內分泌治療可能無效，故針對AR為靶點是ER-/HER2+乳腺腫瘤的潛在治療方法[56]。

3 結論

中醫在臨床上治療乳腺癌的處方大都采用四法聯用，但中藥治療乳腺癌的機制復雜且難以明確。故本研究選擇四法聯用的代表藥，基于現有數據庫，并結合文獻驗證，構建乳腺癌分子調控網絡，并按照中藥-中藥化學成分-化學成分作用靶點-分子調控網絡-疾病相關靶點這一完整的生物學過程建立了分子生物網絡，在分子水平上系統解析所篩選的4 味中藥治療乳腺癌的作用機制。結果表明，4 味中藥中有48 個化學成分會直接或間接的作用于15個乳腺癌相關靶點，從網絡的總體特征以及針對4味中藥中的抗腫瘤成分作用途徑解析，這4 味中藥都存在一個化學成分作用于一個疾病相關靶點的現象。而且可能通過PI3K-Akt信號通路，EGFR 信號通路等多種途徑作用于多個疾病靶點，引起細胞周期阻滯，抑制細胞增殖，降低癌細胞侵襲和轉移能力以及促進細胞凋亡從而起到治療乳腺癌的作用。

本研究利用生物信息學，并整合網絡藥理學方面的知識，嘗試從分子水平上系統地解析常用于治療乳腺癌的中藥，通過作用乳腺癌相關靶點從而治療乳腺癌的作用機制，這為配伍有效成分治療乳腺癌提供了線索和依據，并對藥物研發具有一定指導意義。