白楊素對腦缺血-再灌注損傷的神經保護機制研究＊

王葉葉，江 羽，梁 晨，石 崢，譚 睿,2＊＊

（1.西南交通大學醫學院 成都 610031；2.西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031）

腦缺血是嚴重的腦血管疾病，由于顱內血管阻塞引起腦血流異常，導致局灶性腦組織損傷、神經功能失常。腦缺血在臨床腦血管疾病中最為常見，約占80%[1]，該病發病率高、致殘率高、死亡率高，使患病者生活自理能力降低，嚴重危害人類健康和生活[2]。腦缺血發病后發生缺血級聯反應，梗死區域因缺血出現氧化應激和興奮性毒性，破壞水電離子平衡，造成梗死灶神經元死亡，接著神經炎癥激活，慢性炎癥會導致腦水腫和半暗帶區神經元死亡，從而影響神經功能恢復[3]。腦缺血過程中一個重要特點是神經元大量且快速凋亡，再灌注后很長一段時間內神經元仍然持續凋亡。目前處于臨床研究階段的藥物主要包括溶栓藥、神經保護劑兩類。但溶栓藥安全性低、治療時間窗窄，神經保護劑絕大多數臨床療效較差，促進腦缺血后神經元再生等缺血后神經功能恢復的研究受到廣泛關注，包括干細胞、神經營養因子、小分子藥物等[4]，其中，神經營養因子能促進突觸和軸突重塑及再生，促使神經功能再生[5]，補充神經生長因子（NGF）對于保護神經元具有重要意義[6]。NGF 能促進軸突定向再生[7]，使之與靶細胞形成功能連接，最終修復受損神經細胞，達到改善神經功能缺損癥狀的目的。但是NGF 難以在腦組織中維持理想濃度，直接給予NGF難以發揮穩定的生物學效應。目前已有人提出重組細胞注入法，置管腦外注藥法，神經通路給藥法等[8-9]新的給藥方式給藥，以期NGF達到更穩定的效應。

白楊素（Chrysin）為5,7-二羥基黃酮，是中藥材益智仁的主要黃酮類成分之一，曾從紫葳科植物木蝴蝶中提取得到，是一種具有抗腫瘤、抗焦慮、抗炎、抗氧化等藥理活性的黃酮類化合物[10]，它可以通過上調Nrf2-ARE 信號通路相關蛋白而激活大鼠體內抗氧化酶系和自由基清除系來減輕這些物質對大鼠腦組織造成的損傷，對腦缺血有治療作用[11]。另外，白楊素也可能通過上調p-ERK、同時下調NF-κB和p-P38的表達發揮神經保護的作用[12]。然而，對于白楊素對腦缺血再灌注損傷中如何修復受損神經元方面無報道。

本實驗通過建立的NGF 神經營養因子藥物篩選模型，發現白楊素具有潛在的腦缺血后神經保護作用，在體外實驗中，用白楊素誘導MSC，檢測出MSC 細胞表面多種神經標志性蛋白。而后在體內實驗中，用不同劑量白楊素對腦缺血再灌注大鼠治療，腦梗死、含水量均一定程度降低，且大鼠腦組織NGF、BDNF蛋白也較對照組明顯增加，進而顯示出白楊素通過上調NGF、BDNF蛋白表達發揮腦缺血后神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物和試劑

大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞（PC12 細胞，中國科學院上海細胞所）；MSC 細胞（自提，來源于3-4 周齡SD 大鼠骨髓間充質）；高糖DMEM 培養基(Hyclone，J180003)，L-谷氨酸溶液(Glu，LEAGENE，0404A18)；四甲基偶氮唑鹽（MTT 粉末，銳賽生物公司，180315）；DAPI（谷歌生物有限公司，20180326）；FITC 標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天生物技術公司，A0562）；NGF一抗（谷歌生物，GB11143）；BDNF 一抗（谷歌生物，GB11240）；熒光二抗CY3 山羊抗兔（谷歌生物，GB-21303）；GalC 一抗（Solarbio，K003717P）；Nestin 一抗（碧云天生物技術公司，AF2215）；NSE一抗（碧云天生物技術公司，AF2164）；Vimentin 一抗（Abbkine，ABP-52697）；2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）（源葉生物科技有限公司，BCBR5460V）；4%多聚甲醛（Biosharp，180119）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，G1005）

1.2 實驗動物

60 只6-8 周齡SD 雄性大鼠，清潔級，體質量約280-300 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 PC12細胞培養及細胞存活率檢測

PC12 細胞接種于含有10%胎牛血清，105 U/L 青鏈霉素的DMEM 高糖培養基中，在37℃含5%CO2的細胞孵箱中培養，取對數生長期的PC12 細胞按照2×104個/孔接種于96 孔板中，設置空白組、對照組、谷氨酸損傷組和白楊素給藥組。給藥組24 h 后加入5、10、20、30、50 μM濃度的Chrysin。繼續孵育24 h后各組加入10 mMGlu溶液誘導24 h，對照組不做處理。每孔加入20 μL終濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，培養2-4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO振蕩10 min后于570 nm波長處用酶標儀測取OD值，計算細胞存活率[13]。

1.3.2 白楊素誘導MSC后蛋白含量測定

以NGF 為靶點，利用NGF 的啟動子連接Luc 熒光素酶報告基因，構建質粒模型，并轉染進入HEK-293細胞，建立可用于篩選具有促NGF分泌作用的人胚腎上皮細胞藥物篩選模型。通過此模型篩選出中藥單體白楊素具有潛在神經保護作用，并進一步檢測了白楊素誘導后1、3、5、7 天的MSC 細胞表面神經標志物NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin的表達量。

取3-4周齡SD大鼠，無菌環境下取其骨髓間充質干細胞，DMEM 低糖培養基中培養。適宜密度的MSC接種于六孔板中，1 μM 白楊素預處理24 h 后，加入山羊血清室溫封閉30 min 后吸除，滴加一抗，4℃孵育過夜，加FITC 標記的二抗室溫孵育1 h，復染核后封片，觀察、采集圖像。

1.3.3 白楊素誘導MSC 對大鼠腦缺血再灌注的腦神經保護作用

（1）實驗動物分組與給藥

在實驗室中進行5-7天適應性飼養，自由飲水，正常飲食。術前12 h禁食，自由飲水。實驗前隨機分組，將SPF級SD雄性大鼠隨機分成5組：假手術組（Sham），模型組（Model），白楊素（Chrysin）高、中、低劑量治療組，每組動物12 只。治療組大鼠均灌胃給藥，高、中、低劑量治療組劑量分別為20 mg·kg-1，10 mg·kg-1，5 mg·kg-1。造模24 h 前給藥預保護一次，造模成功后再連續給藥3天。給藥總體積為10 mL·kg-1。

（2）腦缺血再灌注損傷模型的制備

各組大鼠均在灌胃給藥預保護1 天后，禁食不禁水12 h，進行手術，參照Longa 等[14]的方法制備MCAO模型，腹腔麻醉大鼠，在頸部中間切開，鈍性分離肌肉，暴露并分離右側頸總動脈（CCA），頸外動脈（ECA），頸內動脈（ICA），近心端結扎CCA，動脈夾夾閉ICA，在CCA上開一小口，從CCA插入線栓，順著ICA入顱至中動脈，用縫合線縫合傷口，缺血2h 后進行再灌注。假手術組除不插入線拴外其余步驟同上。

圖1 不同濃度白楊素作用下PC12谷氨酸損傷細胞的存活率

1.4 觀察指標

1.4.1 MCAO損傷大鼠神經行為學評分

根據Zea Longa 五分制法[15]對大鼠進行神經功能（modified Neurological Severity Scores，mNSS）評分。在缺血再灌注后2 h、1天、2天、3天分別評分。

1.4.2 大腦梗死體積比的測定

股動脈取血后立即取腦，去除嗅球和小腦，沿冠狀面切成厚度為2 mm的腦片，共5片。放在20 mL的2%TTC 磷酸鹽緩沖液（pH7.6）中，避光，在37 度水浴30 min，染色后，用4%多聚甲醛固定，拍照，計算梗死體積，計算梗死體積比[16]。

1.4.3 腦組織含水量測定

缺血2 h 后再灌注5 天，斷頭處死大鼠，將腦完整取出，除去小腦、低位腦干以及嗅球。用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱量腦濕重，然后再將腦組織進行烘干(105℃，24 h)后稱重，按干濕重法計算腦組織含水量。計算公式：腦組織含水量（%）=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%[17]。

1.4.4 腦組織缺血半暗區組織學改變和海馬CA1 區NGF，BDNF蛋白表達

取腦組織，4%多聚甲醛固定，HE 染色，顯微鏡觀察缺血半暗區的變化；免疫熒光染色觀察海馬CA1區NGF，BDNF蛋白的表達。

1.5 統計學方法

運用Graphpad Prism7 和SPSS18.0 軟件進行統計學分析，數據結果以均數±標準差(xˉ±s)表示。多組數據之間的比較使用單因素方差分析分析結果。P ＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 PC12細胞存活率

細胞存活率實驗（圖1），與谷氨酸損傷對照組相比，在5、10、20、30 和50 μM 的白楊素藥物濃度作用下，白楊素干預組細胞存活率均有上升，其中5、10 μM的白楊素作用下細胞存活率上升顯著（P ＜0.01），20、30 μM的白楊素作用下細胞存活率上升明顯（P ＜0.05）（圖1）。對正常PC12 細胞沒有毒性且在谷氨酸（10 mM）誘導下又對細胞起保護作用的白楊素藥物濃度為10 μM。

2.2 白楊素誘導MSC后蛋白含量測定

MSC 細胞表面神經標志物NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin均有表達（圖2），3天時NSE表達突出，5天時NGF、Nestin、Vimentin 表達較多。經白楊素誘導后，MSC細胞神經營養因子蛋白表達增加。

2.3 大鼠神經行為學評分，腦梗死體積及含水量

結果表明（表1），與模型組比較，假手術組大鼠的神經行為學評分為0，給藥組大鼠神經功能評分均具有不同程度的減小，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1劑量白楊素給藥后2天和3天缺血大鼠神經行為學評分顯著降低（P ＜0.05），差異均具有統計學意義。

與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死明顯（圖3a,b），模型組腦含水量顯著增加（P ＜0.05）（圖3c）。與模型組相比，Chrysin給藥組腦梗死體積均減少，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1劑量Chrysin組梗死體積比與模型組有顯著差異（P ＜0.05）（圖3b），且隨劑量增加，梗死體積逐漸減小。與模型組相比，給藥組腦含水量均有一定降低，但沒有顯著性差異（P ＞0.05）（圖3c），提示白楊素可一定程度減輕神經功能損傷癥狀。

2.4 大鼠腦缺血半暗區組織學染色及海馬CA1 區NGF、BDNF蛋白熒光染色

大鼠腦缺血半暗區組織學染色顯示（圖4），假手術組神經元排列整齊緊密，層次清楚，核膜完整，核仁清晰可見；模型組出現細胞間隙變寬，細胞形態極不規則，深染，核固縮，溶解等細胞壞死特征。與模型組相比，給藥組大鼠神經細胞病變較輕，且Chrysin-20 mg·kg-1組細胞間聯系緊密，空泡狀減少，治療效果顯著。

免疫熒光染色法對腦組織NGF、BDNF 蛋白進行染色（圖5），與假手術組相比，模型組大鼠腦海馬CA1區NGF、BDNF蛋白熒光強度降低，提示其表達量顯著降低（P ＜0.05）；與模型組相比，給藥組大鼠腦海馬CA1區NGF、BDNF蛋白紅色熒光表達有明顯增加，且隨著給藥劑量增加，熒光強度增大，說明在缺血再灌注損傷后，給Chrysin大鼠腦海馬CA1區NGF、BDNF有一定程度增加，這對受損神經細胞有一定的修復作用。

圖2 楊素誘導MSC后不同時間細胞表面神經營養因子NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin的免疫熒光表達（a）×400及表達量（b）

圖3 大鼠腦部TTC染色（a；白色區域代表梗死部位；紅色區域為正常部位）；腦梗死體積（%）（b；￥P ＜0.05：與模型組相比）；腦含水量（%）（c；￠P ＜0.05：與假手術組相比）

表1 各組不同時間神經行為學評分（xˉ±s,n=12）

3 討論

據報道，神經保護治療能恢復神經功能[18]，神經元的存活及維持正常功能依賴于神經營養因子[19]，由于神經營養因子多為大分子肽，難以通過血腦屏障，外周給藥難以到達作用部位，充分誘導內源性神經營養因子的表達可能是治療缺血-再灌注神經元損傷的重要途徑[20]，而BDNF 和NGF 是神經營養因子家族中的重要成員，并且腦缺血后腦神經細胞受損程度與BDNF和NGF的表達含量密切相關[20,21]。

圖4 大鼠腦缺血半暗區HE染色×100

圖5 大鼠腦海馬CA1區NGF蛋白（a）、BDNF蛋白（b）熒光染色×100（藍色：DAPI，紅色：目標蛋白）

本實驗通過藥物篩選模型，發現白楊素具有潛在神經保護作用，將白楊素誘導MSC細胞后檢測MSC細胞神經標志性蛋白，得到NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin 五種神經標志蛋白的較好表達，說明了白楊素可以誘導MSC 細胞向神經樣細胞分化。在此基礎上進行體內驗證，通過建立腦缺血-再灌注動物模型考察了不同劑量給藥組神經功能評分、腦梗死體積、腦含水量的變化，結果顯示白楊素具有減輕缺血-再灌注損傷中神經損傷的作用，同時對各組腦缺血半暗帶進行組織學染色，觀察到給藥后組織空泡減少，聯系緊密，病變減輕。此外，給藥后，損傷部位的NGF、BDNF神經營養因子表達上調也表明白楊素對受損神經細胞有修復作用。實驗結果證實了上調內源性的干細胞表達NGF、BDNF 營養因子是白楊素治療腦缺血再灌注損傷的重要機制。

綜上所述，白楊素通過上調腦缺血-再灌注損傷中NGF和BDNF蛋白表達，減輕神經損傷癥狀，發揮治療神經元損傷的作用。這為缺血性腦損傷的治療提供了新的思路，具有潛在的臨床應用價值。