利用干細胞篩選中藥神經保護作用活性成分的新方法＊

譚 睿，趙 騫，盧 瓊，馬曉玲，李金圣，蔡少青

（1.西南交通大學生命科學與工程學院/醫學院 成都 610031；2.北京大學藥學院 北京 100191）

中藥是中醫防病治病的物質基礎，中藥藥效物質是其所含具有防病治病作用的化學物質，也是質量控制的物質基礎。然而，大部分中藥活性成分尚不明確或只是部分清楚，中藥藥效物質不明確、指標性成分與功效相關性不強、單指標或少數指標性成分的含量測定難以有效控制整體質量等問題普遍存在，嚴重限制了中藥作用機制的闡明和質量標準的提高。

因此，研究中藥復雜體系藥效物質的方法和技術有待提高。尤其是，如何對中藥中具有顯著生理活性、有望成為創新藥物研究重要源頭分子的微量成分進行可靠的活性評價？本文介紹一種利用干細胞篩選中藥中微量活性物質的新方法——“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”，僅需要μg 級單體化合物即可進行潛在的活性篩選。

“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”以啟動子為篩選序列（靶點）進行質粒初篩，配合干細胞體外驗證手段，觀察中藥單體化合物與干細胞共培養過程中，所表現出對某種病灶的修復傾向。根據顯示出可能潛在的相關活性，高效、明確地指向該中藥微量成分的藥效和機制，借以判斷單體化合物活性。其根本原理在于利用干細胞可塑性強、可分化成多種類型細胞的特質。

干細胞具有分化能力恢復因病死亡的細胞，也具有旁分泌能力調節治療因病損傷的細胞，因此在再生治療方面有廣泛的應用。干細胞的分化具有多能性。骨髓間充質干細胞的治療機制分為細胞分化和旁分泌作用，涵蓋面廣。針對細胞治療過程中特定的細胞，或者研究基礎較少、機制較不明確的生物標志物，可以選取分化的目的細胞所特有的標志物，來達到有的放矢的效果。這樣，根據研究目的而構建的獨特細胞系，就可以使篩選的條件盡可能符合研究者想要的藥效。

該模型系首次將干細胞技術應用于藥效篩選模型構建；借以突破中藥微量成分藥效學檢測瓶頸，從種類多、含量低的化合物群中快捷確定活性單體化合物，為中藥藥效物質基礎的發現和闡釋提供科學依據，為中藥微量成分的轉化和應用提供廣闊前景。

1 再生醫學干細胞技術用于快速篩選中藥藥效成分背景

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）廣泛存在于動物成體結締組織和器官間質中，根據來源主要有骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞等類型。MSC 易于分離培養，在體外可以向各種類型的細胞分化，可分化為中胚層細胞，如脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞；可分化成外胚層和內胚層細胞，如皮膚、神經細胞、肝細胞、胰腺胰島等，其表面標志基因不盡相同。

本模型所用骨髓間充質干細胞（BMSCs），是來自SD大鼠成體的非造血干細胞，具自我更新和分化能力如：脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞[1]等，且簡便易得。我們以此為工具細胞，通過建立神經保護單體化合物篩選或血管保護單體化合物模型，詳細闡釋“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”的原理、建立方法和應用。

研究發現，在體外特定培養條件下，骨髓間充質干細胞可向神經干細胞、神經元細胞及少突膠質細胞等神經樣細胞分化，為神經損傷后的修復再生提供了有利支持。二甲基亞砜（DMSO）[2,3]、丁羥基茴香醚（BHA）[2,3]、β-巰基乙醇[4-6]、全反式維甲酸（RA）[2,7]、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）[8,9]等化合物或細胞因子均可誘導BMSCs 向神經樣細胞分化，說明小分子化合物具備誘導BMSCs 向神經樣細胞分化潛力[10,11]。也有研究發現，土木香內酯、辛伐他汀等小分子化合物可以誘導BMSCs 向血管內皮細胞分化的潛力[12,13]。本文的篩選模型旨在篩選和發現具有誘導分化神經細胞或血管細胞的天然小分子化合物。

2 材料

2.1 細胞、藥物和試劑

HEK-293 細胞（來源于美國ATCC）；胎牛血清（Gibco，批號：1908121）；DMEM 低糖培養基（Hyclone，批號：J180003）；胰蛋白酶（Hyclone,批號：J180003）；鹽酸克倫特羅（aladdin，37148-27-9）；維甲酸（南京生利德生物科技，302-79-4）；白楊素（普思生物科技，480-40-0）；楊芽黃素（普思生物科技，520-28-5）；圓柚酮（成都嘉葉生物科技，4674-50-4）；PCR 擴增試劑盒，Lipofectamine?2000（Thermo Fisher，11668019）；兔抗神經生長因子（Beyotime，AF1411）；兔抗半乳糖神經酰胺（Solarbio，K003717P）；兔抗波形蛋白(Beyotime，AF1975）；兔抗巢蛋白（Beyotime，AF2215）；兔抗神經元特異性烯醇化酶（Beyotime，AF2164）、Total RNA Isolation Kit、二步法RT-PCR 試劑盒（成都福際生物技術有限公司，RE-03113）。

2.2 實驗動物

SPF 級2-4 周齡雄性SD 大鼠2 只（由成都達碩實驗動物有限公司提供），平均體質量為120-140 g，用于制備骨髓間充質干細胞。

3 “分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”藥物篩選模型的構建

該模型分為兩部分：分子靶向的高通量篩選、干細胞定向誘導驗證。利用干細胞可塑性強且可分化成多種類型細胞的特質，結合干細胞在單體化合物給藥后的分化趨向和旁分泌作用，高效、快速判斷中藥微量成分可能具有的活性和機制。

3.1 分子靶向的高通量篩選

作為神經細胞或血管內皮細胞生長的標志性基因，神經生長因子（NGF）或血管生長因子（VEGF）的轉錄水平，可表明對神經或血管的修復作用；“分子靶向篩選”是以VEGF 或NGF 啟動子為篩選序列（靶點）進行質粒初篩，將是否促進干細胞啟動VEGF 或NGF 基因的轉錄，作為初步判斷單體化合物是否具有神經或血管保護作用的依據。

（1）分別克隆神經元的保護/再生及血管新生的主要功能基因NGF、VEGF的啟動子片段，各自與紅色熒光蛋白（E2）或者熒光素酶（Luc）表達基因片段整合，后接報告基因，構建能定性和定量評估這兩個基因啟動子功能的質粒；

（2）使用Lipofectamine?2000，將含有NGF、VEGF啟動子的質粒轉染HEK-293細胞，建立穩定的單克隆細胞株，形成具有神經或血管保護的單體化合物高通量篩選體系（圖1），完成前部分“分子靶向篩選”質粒模型構建。

圖1 NGF/VEGF高通量篩選模型的構建

圖1 紅色熒光顯示，以鹽酸克倫特羅（CLE）為陽性藥物進行刺激，質粒中的紅色熒光蛋白（E2）被啟動轉錄，確認該高通量篩選體系構建成功。有報道顯示[14]，對于神經興奮毒素紅藻氨酸誘導的神經細胞凋亡模型中，定量PCR等方法顯示鹽酸克倫特羅可以上調NGF的轉錄水平，從而發揮神經保護作用。由于腦缺血的過程中由于缺血、缺氧等，也伴隨著神經細胞的死亡，因此鹽酸克倫特羅能夠較好的作為腦缺血神經保護的陽性藥物使用，一定程度上反映出細胞模型的準確性。

質粒中的熒光素酶被啟動轉錄的情況（表1）。空白組為未轉入質粒的HEK293細胞。對照組組為轉入含有相應啟動子和熒光素酶基因的質粒。相對熒光素酶單位的結果對比顯示，該質粒被成功轉入細胞模型。CLE 組為加入鹽酸克倫特羅（CLE）后的熒光強度，是對照組的156%，顯示明顯的提高。

當待測藥物處理使啟動子被激活時，則啟動紅色熒光蛋白表達或者熒光素酶活性提高，借以快速直觀反映單體化合物潛在的神經或血管保護活性。

3.2 干細胞定向誘導驗證模型

將3.1“分子靶向篩選”顯陽性的單體化合物，與骨髓間充質干細胞（BMSCs）共培養，檢測BMSCs 上標志基因NGF 和VEGF 轉錄，推測單體是否潛在的神經或血管保護活性；當然，單體化合物也可能具有誘導BMSCs 分泌治療因子作用，但無論是單體化合物的直接誘導分化，還是促進相關因子分泌，均顯示該單體化合物具潛在神經保護或血管保護活性。

上述兩部分整合，即為“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”，可用于中藥微量單體（微克級）篩選，并同時準確指向單體化合物的藥效作用及潛在機制。

表1 轉入NGF啟動子質粒的HEK293細胞受CLE誘導熒光素酶的變化

我們建立的神經保護/再生“分子靶向篩選+干細胞定向誘導”模型，其機理在于：神經生長因子（NGF）、干細胞、小分子藥物等都是[15]促使神經功能再生[16]的重要因素，NGF能促進突觸和軸突重塑及定向再生，通過藥物誘導機體干細胞分化或分泌，補充NGF，使之與靶細胞形成功能連接，達到修復受損神經細胞、改善神經功能缺損癥狀的目的[17,18]。

據報道，目前將成纖維細胞逆分化為多能干細胞，并誘導成神經細胞，并檢測到神經分化相關的指標等的重大發現[19]，均系采用多種體內已知的、活性明確的化合物聯合誘導所得；而本課題組則是首次單獨采用來源于中藥的單一天然小分子化合物進行大鼠BMSCs誘導，并檢測到神經分化相關指標等，具有重大的意義；也是首次將干細胞作為模式細胞運用于中藥單體化合物活性篩選。這可為如何從含有化合物種類多、含量低但臨床療效確切的中藥中尋找活性成分，闡釋中藥藥效物質基礎提供新方法和新思路，為中藥藥理學和中藥質量控制研究提供新借鑒。

4 采用“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”篩選中藥神經保護成分的實例

我們以中藥益智為例，展示如何構建神經保護活性的“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”，對益智的3個黃酮類成分進行抗神經損傷化學成分的篩選。

圖2 益智仁中3個中藥單體誘導bMSC基因轉錄強度的定量RCR檢測

表2 使用NGF啟動子篩選體系檢測得到三種化合物和對照組相比相對熒光強度

4.1 實驗方法與結果

4.1.1 NGF高通量模型的構建

HEK-293 細胞（人胚腎上皮細胞）是真核蛋白表達常用的細胞之一，它具有以下優勢：更快的生長速度，更高的生長密度、轉染效率和外源蛋白表達量。因此，廣泛應用于外源性基因轉染的載體，以及蛋白表達體系的構建等。通過lipo2000 將構建成功的質粒轉染進入HEK-293 細胞，成功構建穩轉細胞株（圖1）。當啟動子被激活，可促進熒光素酶基因的轉錄并提高其蛋白的表達，通過檢測熒光素酶的活性來直觀快速顯示單體化合物是否可能具有神經或血管保護活性。

4.1.2 具有上調NGF作用的中藥單體化合物的篩選

針對益智仁的3個黃酮類單體化合物（白楊素、楊芽黃素和圓柚酮），以維甲酸（RA）為對照，采用前述分子靶向篩選高通量模型，測試各單體是否具有刺激細胞模型中NGF啟動子轉錄作用。3個被測單體化合物的熒光素酶表達強度均高于對照品維甲酸，且圓柚酮的表達量最強（表2）。

4.1.3 單體對BMSCs神經樣細胞分化的誘導

為進一步驗證單體化合物活性，以10 μmol·L-1的濃度，將各單體分別與BMSCs 共培養1-7 d，測定其基因轉錄水平，觀察是否具有神經樣或血管內皮樣細胞分化的潛力。經3 個單體化合物的誘導培養，BMSCs表面的5個神經細胞標志蛋白：神經生長因子（NGF）、半乳糖神經酰胺（GalC）、巢蛋白（Nestin）、神經元特異烯醇化酶（NSE）、波形蛋白（Vimenti）所對應的基因轉錄明顯上調，說明BMSCs 經過藥物誘導后，具有向神經樣細胞分化的作用，推測該3個單體化合物白楊素、楊芽黃素和圓柚酮可能具有神經保護活性（圖2）。

本實驗設3種單體化合物實驗組（白楊素、楊芽黃素和圓柚酮組），陽性對照（維甲酸組），陰性對照（DMSO 組），用各單體化合物處理BMSCs，檢測在BMSCs細胞表面前述5種標志基因的mRNA轉錄水平變化。將陰性組（DMSO）的基因轉錄情況視為1，其他的每組轉錄情況除以陰性組轉錄情況，計算得到各組的相對轉錄強度。

由圖2 數據可見：各組與陽性對照維甲酸RA 相比，誘導趨勢基本一致；第3 天，各實驗組誘導BMSCs產生NSE基因相對轉錄水平均達峰值；第5天，白楊素（chrysin）組產生的NGF、Nestin和Vimentin基因轉錄水平均達峰值，GalC 則在第7 天達峰值；楊芽黃素（tectochrysin）組各基因轉錄水平上調量幾乎都弱于對照維甲酸RA。本數據作為基因轉錄水平，反映了細胞內對應的神經相關mRNA 的轉錄效率，對應當天該蛋白增加的情況。對于NGF、NSE、Vimentin 來說，若3 d已經合成了足夠多的蛋白并在細胞內積累達到飽和，則不需要繼續保持高轉錄強度，也能發揮該蛋白的功能。因此部分基因在5 d或者7 d后相對轉錄水平發生下降。數據顯示BMSCs 在受到白楊素、圓柚酮干預后，神經細胞特征性和分化相關的多種基因轉錄水平均發生了上調，推測兩種單體化合物白楊素、圓柚酮具有提高BMSCs中某些神經細胞分化基因的轉錄水平、促進神經分化的生物活性，是益智仁發揮神經保護作用的藥效物質基礎組成部分。

4.1.4 單體化合物的體內藥效學驗證

針對單味中藥和復方成藥中的神經保護活性成分，我們采用“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”，各自進行相應單體化合物篩選，然后，逐一進行體內藥效實驗驗證。

（1）單味中藥的神經保護單體化合物驗證

從中藥益智仁中，篩選出2 個具神經保護作用單體，依次為白楊素、圓柚酮。為驗證體內藥效，課題組采用腦缺血-再灌注模型體內藥效實驗，進行了白楊素對腦缺血-在灌注損傷神經保護作用和機制的相關研究驗證，詳見本刊“白楊素對腦缺血-再灌注損傷的神經保護機制研究”一文。通過建立腦缺血-再灌注大鼠模型考察了不同劑量白楊素給藥組神經功能評分、腦梗死體積、腦含水量的變化，結果顯示白楊素具有減輕缺血-再灌注損傷中神經損傷的作用，同時對各組腦缺血半暗帶進行組織學染色，觀察到給藥后組織空泡減少，聯系緊密，病變減輕。綜上所述，體內藥效實驗證實：白楊素通過上調腦缺血-再灌注損傷組織部位中NGF 和BDNF 蛋白表達，促進神經細胞的再生，減輕神經損傷癥狀，發揮治療神經元損傷的作用。

（2）經典成方十五味木香丸神經保護活性成分驗證

針對臨床應用廣泛的藏藥經典名方，我們追蹤到病人入血成分之一，一種倍半萜內酯類化合物--木香烴內酯（costunolide）。以木香烴內酯為誘導劑，用“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”體外檢測出其對BMSCs 向神經樣細胞分化的誘導作用，用腦缺血-再灌注損傷大鼠模型體內驗證其神經保護藥效，詳見本刊“木香烴內酯誘導骨髓間充質干細胞用于腦缺血再灌注損傷治療”一文，也與臨床療效和文獻報道[20]不謀而合；

（3）經典名方如意珍寶丸神經保護活性成分驗證

我們對中動脈阻斷缺血大鼠進行藏藥名方灌胃給藥，采用HPLC進行口服給藥前后血液成分對比，追蹤到血清中兩種含量較大的單體成分鞣花酸（ellagic）和木犀草素（luteolin），將2種單體化合物加入至E2高通量篩選模型中，均可上調HEK-293 細胞中的E2 熒光素酶表達，顯示具神經保護作用；又與BMSCs 共培養后，經誘導后的BMSCs顯著性地上調了神經細胞的標志性基因的轉錄水平，說明單體鞣花酸和木犀草素可誘導BMSCs 向神經樣細胞分化或具有神經保護樣作用。最后，進行體內神經保護藥效實驗驗證，單體鞣花酸和木犀草素均能顯著減少缺血再灌注引起的腦組織梗死體積（TTC染色），減輕腦水腫率，保持組織結構完整（H&E 染色），顯著性的減少損傷部位細胞凋亡，從而降低神經元損傷，證實了從藏藥名方如意珍寶丸中提取得到的單體鞣花酸、木犀草素能減輕腦缺血損傷癥狀，具有神經保護活性[21-23]。

綜上所述，運用“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”篩選，可對單味中藥和復方成藥中的微量單體化合物進行活性篩選，且結果均準確、可靠。

5 結論

我們以質粒初篩配合干細胞體外誘導，建立“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”，快速發現中藥單味藥和復方中潛在的神經保護或血管修復活性成分，該微量成分活性篩選方法，簡潔、快速，具有較好準確性和可靠性；由于時間有限，我們僅僅進行了神經保護/血管保護活性的模型構建，即：以NGF 啟動子質粒模型結合BMSCs 共培養，檢測5 種神經標志基因用于神經保護活性單體的篩選；和通過VEGF 啟動子質粒模型結合BMSCs 共培養，檢測3 種血管標志基因用于血管保護活性單體的發現（數據已發表[23]），另外，關于肝臟、腎臟保護修復其他活性單體篩選模型和驗證實驗正在進行。

值得一提的是，神經損傷和血管損傷為腦缺血兩個主要要素，采用我們的“分子靶向篩選+干細胞定向誘導模型”，配合體內中動脈阻斷-再灌注經典模型藥效實驗，為尋找新的抗腦缺血候選藥物分子提供新思路和新工具。

6 討論

傳統單體化合物活性篩選方式多以模型細胞的存活率作為藥物活性的評判標準（如MTT，CCK8），其優勢為通過給藥濃度與細胞生存率等直觀指標，快速判斷單體化合物活性，但若需明確作用靶點及機制，則必須進行體內藥效實驗研究，單體消耗量大、作用靶點難以明確。

圖3 來自三個藏藥的17個小分子化合物對NGF基因表達的影響

此外，亦有利用親和色譜法通過單體化合物與作用靶點的特異性吸附，對與靶點相結合的藥物進行洗脫、鑒定是目前篩選微量活性化合物的熱點方案，相對于傳統藥物篩選模式具有一定優勢，但僅能鎖定對作用靶點具特異性靶向作用的單體化合物，若系因調節其他生物因子間接起效的單體分子，則會漏篩，而且可與靶點結合的小分子不一定都是活性成分，可能并不引起下游生物通路的改變，甚至起到相反抑制作用。因此，該方法實質上并未完全突破中藥微量成分活性研究瓶頸，其準確性和效率有待提高。

以單基因作為指標進行篩選的模型，多以靶基因調控序列中特定轉錄因子或受體的結合位點為靶點，靶點單一、篩選得到僅針對單結合位點的活性成分。而基因啟動子序列中往往含多個、多種不同調控因子的結合位點，故本文模型前部分以啟動子為篩選序列（靶點），有望獲得影響該基因表達大類成分，擴大了篩選范圍，后利用干細胞可塑性強、可分化成多種類型細胞的特質，測定干細胞表面表達的特定標志基因，借以高效、快速判斷微量單體化合物活性和可能機制。該方法相對傳統方法具有可篩選范圍廣、效率高、準確性高的優勢。例如本課題組對來自三個藏藥（如意珍寶丸、二十味沉香丸、二十五味珊瑚丸）的17種小分子化合物使用NGF-293 細胞模型進行篩選。這17 種化合物覆蓋了黃酮類，萜類，苯丙素類、胡蘿卜素類等多種類別。結果顯示，其中有3種化合物（分別為1種黃酮類、2 種萜類）對NGF 啟動子有較為明顯的上調作用（圖3）。進一步使用干細胞研究的結果（圖4），1和16兩種化合物對bMSC細胞中NGF啟動子有較好的上調作用[24]。這證明了本篩選體系在待測化合物較多的時候仍然能有保持較高的效率，并可以驗證得到有促進神經相關因子分泌提高的化合物。此外，本課題組針對VEGF 也建立了不同的藥物篩選干細胞模型，檢測了木香烴內酯、芒果苷等4 種化合物對VEGF-293 細胞的轉錄激活作用，以及對bMSC 中CD31、α-SMA 等與血管再生有關的基因轉錄水平[25]。同時，本研究在體外建立了基于干細胞技術的藥物篩選模型。首次發現，在中藥單一天然小分子誘導下，大鼠骨髓間充質干細胞可向神經細胞分化，并轉錄了與神經干細胞、神經元、少突膠質細胞等分化相關的基因。這不僅為神經損傷后修復以及再生提供了有利的證據，有助于含量低的中藥化學成分生物活性的發現，也可以通過干細胞的多能性、選擇性，為中藥微量成分的臨床應用和干細胞移植提供參考。

面對現今中藥藥效物質不明確、指標性成分和藥效關聯性不強、少數指標成分的含量測定無法控制整體質量等關鍵問題，本技術有助于發現更多來自中藥的小分子活性化合物，強化整體控制、多成分控制、特征專屬性控制，為完善中藥質量評價模式、提高中藥標準水平、闡釋中藥藥效物質基礎，提供了具有原創性和實用性的研究思路和方法體系。

圖4 來自三個藏藥的兩個化合物對bMSC細胞NGF基因轉錄水平的影響