血清miR-21在多囊卵巢綜合征患者中的表達及臨床意義*

連 梅 郭玉佳 陳麗紅 陳劍鋒 陳淑賢

福建醫科大學附屬第一醫院婦產科，福建省福州市 350004

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)是育齡期婦女最常見的內分泌疾病之一,發病率高達6%～8%,其中50%～70%的PCOS患者可引起女性生殖功能障礙和內分泌代謝紊亂[1-2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類可調控轉錄水平基因表達的小分子非編碼RNA，在卵巢激素的生成、卵泡生長發育、排卵以及黃體功能形成過程中發揮重要的調節作用，而激素水平及卵泡發育的異常是PCOS的主要臨床特征[3]。近期的研究表明，miR-21在PCOS女性中表達異常，可能與PCOS的發病機制相關[4]。本研究通過檢測血清miR-21在PCOS患者中的表達情況，分析其用于診斷PCOS的臨床應用價值，旨在為PCOS的早期診斷及靶向治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2018年10月在我院未經治療的初診PCOS患者150例，年齡22～39歲，平均年齡(27.90±2.80)歲。根據胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)將150例PCOS患者分為PCOS胰島素抵抗組(n=96，HOMA-IR≥2.57)和PCOS非胰島素抵抗組(n=54，HOMA-IR<2.57)。納入標準：(1)符合2003年荷蘭鹿特丹會議上修訂的PCOS診斷標準；(2)不孕病史>1年；(3)配偶生殖功能正常。排除標準：(1)嚴重肝腎疾病、內分泌代謝疾病及其他結締組織病；(2)全身炎性疾病、腎上腺疾病、高泌乳素血癥；(3)近期有激素類藥物服用史。另選擇同期因男方因素不孕而接受體檢的健康女性50例作為對照組，年齡23～37歲，平均年齡(27.60±2.50)歲。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取：空腹抽取靜脈血3ml置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫2 500r/min離心15min，分2層，吸取上層血清400μl轉移至1個EP管中，加入1ml提取劑(Trizol)，于-70℃保存。從-70℃冰箱取出上述保存在EP管的細胞，按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。

1.2.2 miR-21逆轉錄及RT-PCR：應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉錄已定量的RNA，選用U6作為內參，反應體系為15μl，反應參數為：16℃ 30min；42℃ 30min，85℃ 5min。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反應體系為20μl：TaqMan MicroRNA Assay1.00μl，cDNA1.33μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00μl，ddH2O 7.67μl，混合后離心放入定量 PCR儀。擴增條件為：95℃預熱10min，95℃變性15s，60℃退火60s，45個循環，最后38℃延伸5s，實驗重復3次。以U6為內參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3 檢測指標：全自動生化儀檢測空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)、總膽固醇(Total choiesterol，TC)、三酰甘油(Triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholestorol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholestorol，HDL-C)。

2 結果

2.1 PCOS組和對照組基線資料比較 PCOS組HOMA-IR明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。PCOS組和對照組的年齡、BMI、腰圍、臀圍、收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL-C、HDL-C及FBG比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 PCOS組和對照組基線資料比較

注：1mmHg=0.133kPa。

2.2 PCOS組和對照組血清miR-21表達水平比較 PCOS組血清miR-21表達水平為1.76±0.38，明顯高于對照組的0.50±0.07，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 PCOS胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組血清miR-21表達水平比較 胰島素抵抗組血清miR-21表達水平為2.65±0.80，明顯高于非胰島素抵抗組的0.55±0.08和對照組的0.50±0.07，差異有統計學意義(P<0.01)。非胰島素抵抗組和對照組血清miR-21表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 血清miR-21對PCOS的診斷價值 當血清miR-21表達水平取最佳截值為1.28時，其診斷PCOS的AUC為0.795(95%CI：0.734～0.854)，敏感度和特異度為76.4%和74.8%。見圖1。

圖1 血清miR-21表達水平診斷PCOS的ROC曲線

2.5 血清miR-21與HOMA-IR的相關性 Pearson相關分析顯示，PCOS患者血清miR-21與HOMA-IR呈正相關(r=0.817，P<0.01)，對照組血清miR-21與HOMA-IR無明顯相關(r=0.138，P>0.05)。

3 討論

PCOS是青春期及育齡期最常見的一種復雜、多因素的內分泌紊亂性疾病，是引起育齡期女性不孕的主要原因，對育齡期女性生理心理健康造成嚴重影響[5]。miRNA作為轉錄后調控的內源性非編碼小分子RNA，在正常或病理條件下的細胞和組織中發揮著重要的作用，能夠調控多種生物過程，包括細胞增殖、發育、分化、死亡，DNA修復、免疫功能等，參與多種疾病的發生發展過程[6]。有研究表明，miRNA在PCOS的血液、卵泡液、顆粒細胞及卵泡膜細胞中異常表達，其可能通過調節生殖、激素分泌和代謝、細胞增殖和凋亡、卵巢卵泡發育相關基因而發揮其生物學功能，參與PCOS的發病[7]。Concha等[8]研究證實，miRNA可能通過其靶基因和通路影響卵泡的發育、顆粒細胞的凋亡、類固醇激素合成、胰島素敏感性，從而影響PCOS的病理生理過程。另有研究認為，miRNA通過對胰島素信號通路中的關鍵性蛋白絲裂原活化蛋白激酶、胰島素樣生長因子1、胰島素受體底物、蛋白激酶B和促性腺激素釋放激素進行調控，從而使通路異常，導致胰島素抵抗，進而促進PCOS的發生和發展[9]。

本研究結果顯示，PCOS組血清miR-21表達水平均明顯高于對照組，提示血清miR-21在PCOS患者中呈高表達，對PCOS疾病發展具有促進作用。Naji等[10]研究也表明，miR-21表達水平與卵母細胞發育情況緊密相關，在PCOS患者顆粒細胞和卵泡液中異常表達，可能在PCOS的高雄激素狀態的發病機制中起著關鍵的作用。本研究中胰島素抵抗組血清miR-21表達水平均明顯高于非胰島素抵抗組，提示miR-21與PCOS患者胰島素抵抗的嚴重程度有關，其表達水平越高，PCOS患者胰島素抵抗癥狀越嚴重。相關性分析也顯示，PCOS患者血清miR-21與HOMA-IR呈正相關，由此推測血清miR-21高表達與胰島素抵抗相關，可能是PCOS患者出現胰島素抵抗的重要病理機制之一。

本研究通過繪制ROC曲線評價miR-21表達水平對PCOS的診斷效能，結果顯示當血清miR-21表達水平取最佳截值為1.28時，其診斷PCOS的AUC為0.795(95%CI：0.734～0.854)，敏感度和特異度為76.4%和74.8%，提示miR-21對PCOS診斷具有一定的臨床應用價值。Jiang等[11]研究發現，與正常人相比，PCOS患者血清miR-21明顯升高，通過靶向調控LATS1促進PCOS的進展，并可作為診斷PCOS的新型非侵襲性生物標志物。

綜上所述，PCOS患者血清miR-21表達水平明顯升高，miR-21高表達可能參與了PCOS患者胰島素抵抗的發生發展，對PCOS診斷具有一定的臨床應用價值。但miR-21在PCOS中的具體發病機制，尚需更多的臨床實驗研究進一步證實。