調脂方對ApoE-/-小鼠動脈斑塊及端粒酶—端粒系統的影響*

劉永源 梁東輝 林 敏 張 薇 黃曼萍 彭春麗

1 南方醫科大學珠江醫院中醫科,廣東省廣州市 510280； 2 廣州市花都新街社區衛生服務中心

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)引起的心腦血管疾病是威脅人類健康的重要疾病。血脂代謝紊亂是AS形成的重要因素。研究表明血脂異常在AS早期起著重要作用，在早期及時對血脂異常人群進行干預，有助于預防AS形成，降低心血管疾病的發病風險[1]。近年來對端粒酶—端粒系統的研究提示端粒功能失調與AS有著密切的關系，由端粒縮短引起的局部內皮細胞復制衰老和功能障礙在冠狀動脈粥樣硬化始動環節中發揮重要作用，而在AS晚期，端粒和端粒酶可能參與斑塊中平滑肌細胞的衰老，進而誘導斑塊破裂[2]。調脂方為我院中醫科梁東輝教授經驗方，入選為國家中醫藥管理局“十一五”重點專科、重點病種協作組制定的高脂血癥診療方案中的調脂協定基礎方，臨床觀察研究顯示對血脂調節療效顯著[3]，方中的主藥主要有效成分提取物丹參總酚酸、山楂總黃酮配伍可增強降脂和抗氧化效應，具有協同增效作用[4]。本研究旨在觀察調脂方對ApoE-/-小鼠血脂、炎癥因子及端粒酶—端粒系統的影響，探討調脂方抗AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和造模、分組 根據研究需要以30只雄性ApoE-/-小鼠作為研究對象，平均周齡(8.2±1.3)周，體重(200±20)g，在我院心臟中心實驗室飼養。造模前給予小鼠基礎飼料適應性喂養2周后，數字表法隨機分為模型組、阿托伐他汀組、中藥干預組，每組10只。另取同周齡雄性C57BL/6小鼠10只作為空白對照組。小鼠均由南京建成生物工程研究所提供，合批號：20080613。

1.2 方法

1.2.1 喂養方法：空白對照組用普通飼料喂養；30只ApoE-/-小鼠均全程給予特制的高脂飼料(78.85% 原糧 +21% 豬油 +0.15% 膽固醇)喂養，共24周。模型組10只ApoE-/-小鼠從高脂飼料喂養12周后開始灌服蒸餾水，1次/d。中藥干預組10只ApoE-/-小鼠從高脂飼料喂養12周后開始灌服中藥調脂方，1次/d，持續時間為12周。調脂方組成：澤瀉30g、丹參15g、決明子12g、何首烏15g、郁金12g、山楂15g。給藥劑量為17.34g/(kg·d)標準灌胃給藥，以上藥物由本院中藥房1次性購齊并鑒定，按水提醇沉法,制成顆粒，用蒸餾水溶解后給中藥干預組小鼠灌胃給藥。阿托伐他汀組10只ApoE-/-小鼠從高脂飼料喂養12周后開始以阿托伐他汀鈣8.22mg/(kg·d)灌胃給藥，1次/d，持續時間為12周。每只小鼠飼養環境相同(飼養條件SPF級,室溫22～24℃, 相對濕度為50%,光照時段為7:00—19:00)，均自由飲水。

1.2.2 取材：所有小鼠實驗飼養24周達到實驗時間后取材，取材前小鼠禁食12h，無菌條件下，將小鼠麻醉后摘眼球取血，3 000rpm離心15min 分離血清。將小鼠處死后打開腹腔和胸腔，輕輕沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長主動脈，用于制備石蠟切片。

1.3 指標檢測

1.3.1 血脂、炎癥指標檢測：送我院檢驗科，運用生化儀檢測脂代謝指標：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及炎癥指標:超敏C反應蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)。

1.3.2 采用進行油紅“O”染色，觀察斑塊形成及脂質堆積程度：實驗末小鼠處死后，各組小鼠行主動脈冷凍切片油紅“O”染色:(1)硅化載玻片粘取冷凍切片，切片干燥后入60%異丙醇浸洗10min。(2)油紅“O”工作液染色10min。(3)60%異丙醇分化3～10s至間質清晰，水洗。(4)Mayer蘇木精復染1min，自來水返藍。(5)濾紙小心吸干水分，甘油明膠封片。依據每個標本連續切片的染色結果，選擇AS斑塊面積最大的切片做病理形態學分析。

1.4 外周血白細胞端粒酶—端粒檢測

1.4.1 提取外周血白細胞RNA：嚴格按照無菌操作要求及說明書中操作步驟提取外周血白細胞RNA，采集小鼠肝素抗凝血，在其中加入等量淋巴細胞分離液混合，以2 000轉/min作離心處理，時間20min。將懸浮物去除，從中單獨將白細胞層分離出來，按照1∶3比例加入生理鹽水混勻，再次離心將上清液完全去除，采用0.01M的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，在沉淀中加入1ml TRISzol。在含有1ml DEPC水的試管中加入10μl RNA，檢測波長為260mm的吸光度，計算RNA濃度。

1.4.2 提取DNA：經TRIzol提取外周血白細胞RNA后，在剩余的界面相、酚相中提取DNA，具體操作方法為：分別在DNA所在界面相、酚相中添加300μl無水乙醇，反復離心2次，轉速、時間同上，將懸浮物取出后在沉淀中加入乙醇，以0.01M的磷酸鹽緩沖液反復沖洗，放置在30℃室溫孵育。20min后干燥，處理完成后加入50μl DEPC水，溶解沉淀。DNA濃度(μg/ml)=50×A260×稀釋倍數/1 000。

1.4.3 設計引物：參考雷大洲等[5]與陳君柱等[6]研究成果，以36B4為參照基因，采用Primer 5.0進行Foreard、Telomerase、Internal control gene端粒、端粒酶引物序列檢索。

1.4.4 PCR：參照試劑說明書配置20μl：2×SYBR Premix Ex Taq 10μl PCR(熒光定量)反應體系，參數設置：上游引物、下游引物、Cdna、dH2O 分別為1μl、1μl、2μl、6μl。根據T(定量PCR中端粒)/S (單個拷貝的基因)得出端粒長度數值，且與端粒平均長度呈正相關。

2 結果

2.1 血脂及炎癥指標 與空白對照組比較，模型組血清脂代謝指標中TG、 TC、LDL和炎癥指標hs-CRP、IL-6均明顯升高(P<0.01)，提示造模成功。與模型組比較，阿托伐他汀組TC、LDL、HDL、hs-CRP顯著下降(P<0.01)，TG、IL-6亦下降明顯(P<0.05)；中藥干預組TG、TC、HDL、 hs-CRP、IL-6顯著下降(P<0.01)，LDL亦明顯下降(P<0.05)；與阿托伐他汀組比較，中藥干預組降低TC的作用較弱(P<0.05)，而中藥干預組在降低TG程度上優于阿托伐他汀組(P<0.05)，在降低LDL、hs-CRP、IL-6及升高HDL上無明顯差異。見表1。

表1 各組血脂水平及炎癥指標指

注：#P<0.01 VS空白對照組；△P<0.05、☆P<0.01 VS 模型組；▲P<0.05 VS中藥干預組。

2.2 主動脈病理 光鏡(×250nm)下可見：本研究空白對照組中小鼠主動脈各層排列整齊，結構清晰，細胞形態良好，少見皺褶、空泡，主動脈根部內膜有增厚現象，但無AS病灶，見圖1A；從圖1B可見，小鼠主動脈血管內皮細胞伴有明顯異常征象，如厚度增加、血管壁周徑縮小、斷裂等，炎性病灶范圍增加，動脈粥樣硬化區域脂質呈鮮紅色，細胞核呈藍色，間質無色，提示存在AS病變；AS斑塊壓迫、平滑肌細胞萎縮、彈力纖維破壞，中膜逐漸變薄；在薄纖維帽之下可見大量不定形壞死崩解產物、呈針狀空隙的膽固醇結晶；肌層排列紊亂，血管壁變薄、層次結構不清晰，而中藥干預組圖1C和阿托伐他汀組圖1D雖同樣存在AS斑塊，但程度較模型組明顯改善。

A B C D

圖1主動脈病理光鏡(×250nm)圖

A.空白對照組，B.模型組，C.中藥干預組，D.阿托伐他汀組

2.3 外周血白細胞端粒長度、端粒酶活性 模型組外周血白細胞端粒長度明顯短于空白對照組、外周血白細端粒酶活性低于空白對照組(P<0.05)。與空白對照組比較，中藥干預組端粒酶活性、阿托伐他汀組端粒長度、端粒酶活性明顯提高(P<0.01)，中藥干預組端粒長度亦有提高(P<0.05)。與模型組比較，中藥干預組與阿托伐他汀組外周血白細胞端粒長度、端粒酶活性均明顯提高(P<0.01)，中藥干預組與阿托伐他汀組之間外周血白細端粒長度及端粒酶活性則無明顯統計學差異。見表2。

3 討論

表2 各組端粒長度、端粒酶活性

注：#P<0.05、□P<0.01VS 空白對照組；☆P<0.01 VS模型組。

AS是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，嚴重危害人類健康。血脂代謝紊亂是AS形成的重要因素，研究表明血脂異常在AS早期起著重要作用，在早期及時對血脂異常人群進行干預，有助于預防AS形成，降低心血管疾病的發病風險[1]。調脂方為我院中醫科梁東輝教授經驗方，入選為國家中醫藥管理局“十一五”重點專科、重點病種協作組制定的高脂血癥診療方案中的調脂協定基礎方，臨床觀察研究顯示對血脂調節療效顯著[3]，方中主藥的主要有效成分提取物丹參總酚酸、山楂總黃酮配伍可增強降脂和抗氧化效應，具有協同增效作用[4]。本研究結果表明，中藥干預組小鼠灌服調脂方后脂代謝指標、炎癥指標較模型組明顯改善，降脂幅度雖略低于阿托伐他汀組，但差異無統計學意義；在病理形態上觀察，調脂方對模型小鼠主動脈AS病變亦較模型組明顯改善，以上結果提示調脂方具有類似于他汀類藥物調節脂代謝、炎癥指標及干預AS病變作用。病理形態上調脂方對AS斑塊影響不及阿托伐他汀考慮與中藥起效作用較緩有關，但在調節高密度脂蛋白上，調脂方有升高高密度脂蛋白趨勢。

端粒是短的多重復的非轉錄序列(TTAGGG)及一些結合蛋白組成特殊結構，能夠保護染色體末端免于融合和退化、提供非轉錄DNA的緩沖物，在染色體定位、復制、細胞凋亡、細胞轉化等生命活動中發揮著重要的作用。端粒酶是一種由RNA和蛋白質組成的特殊反轉錄酶，與真核生物細胞DNA末端的端粒合成明顯相關，正常狀態下體細胞端粒長度會隨著細胞分裂逐漸縮短，同時端粒酶活性增強，促使細胞增殖。近年來對端粒酶—端粒系統的研究提示端粒功能失調與AS有著密切的關系，另外發現端粒長度改變是誘發心腦血管疾病患者血管內皮細胞衰老、障礙的獨立危險因素，隨著疾病進展，上述兩者相互作用可影響血管斑塊中平滑肌細胞，誘導其加快衰老[2]。Matthews等[7]研究報道，心腦血管疾病患者病變位置平滑肌細胞端粒與正常人群相比明顯異常縮短，且端粒越短，說明動脈粥樣病變程度越高，臨床給予他汀類藥物治療方案的出發點：即在于其藥理機制能夠作用于長外周血淋巴細胞端粒長度，從理論上而言具有可行性[8-9]。另外從心血管發病機制角度分析，端粒、端粒酶導致的血管內皮細胞損傷與炎性反應是共同產生的，在導致心功能障礙的同時，還會影響白細胞在血液循環中的含量。鑒于此，臨床常采用白細胞檢測的方法對心血管疾病進行篩查，具有方便易行、操作簡單等特點，可通過檢測外周血白細胞端粒長度反映疾病病變程度。多個流行病學研究探討了外周血白細胞端粒長度與動脈粥樣硬化性血管疾病發生風險的關系[10]。本研究結果顯示AS模型小鼠外周血白細胞端粒長度縮短、端粒酶活性降低，提示端粒酶—端粒系統參與了AS過程；經調脂方及他汀藥物治療后外周血白細胞端粒長度、端粒酶活性較模型組明顯改善，而且高于空白對照組，但AS斑塊尚未能達到空白對照組水平，考慮與AS為多因素共同作用結果有關，端粒酶—端粒系統在AS過程的作用機制有待進一步深入研究，方能助于心血管疾病治療和預防中提供新靶點。