2,4-D處理對大百合種子休眠解除及內(nèi)源激素變化的影響

李鳳榮 李葉芳 馬詩雨 關(guān)文靈

( 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201)

大百合（Cardiocrinum giganteum）是百合科（Liliaceae）大百合屬（Cardiocrinum）多年生鱗莖類草本植物[1]，該屬植物因植株巨大并具有網(wǎng)狀脈的葉片而顯著區(qū)別于百合屬（Lilium）植物[2]。大百合植株粗壯挺拔，葉片碩大，花朵潔白芳香，具有極高的觀賞價值，其鱗莖富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，可供食用[3]，也可藥用[4]；果實可入藥，作為馬兜鈴（Aristolochia debilis）的代用品[5]，是優(yōu)良的野生植物資源。

國內(nèi)關(guān)于大百合的研究主要集中在其引種栽培[6]、組織培養(yǎng)[7]、細(xì)胞水平[8]以及雜交[9]等方面。而國外鮮有對大百合屬的研究，主要在其種子生物學(xué)[10]、生活史[11]、花粉發(fā)育[12]等方面。關(guān)文靈等[13]的研究表明大百合種子存在形態(tài)和生理后熟現(xiàn)象，其休眠類型屬于復(fù)雜的形態(tài)生理休眠。蔡薇等[14]研究變溫層積過程中加赤霉素（GA3）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、硝普鈉（SNP）處理對大百合種胚后熟的影響。2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），是一種人工合成的植物生長素，具有促進(jìn)細(xì)胞生長與分化，加速根、芽伸長，促進(jìn)果實形成與種子萌發(fā)等作用[15]。目前，鮮見2,4-D浸種處理對大百合種子休眠解除的研究，也未見內(nèi)源激素在大百合種子變溫層積過程中變化的研究。本研究采用2,4-D浸種處理結(jié)合變溫層積的方法，探究對大百合種子休眠破除的影響，篩選出適宜的濃度，在最佳處理濃度的基礎(chǔ)上，研究大百合種子在不同時期內(nèi)源激素的動態(tài)變化，為揭示內(nèi)源激素在大百合種子休眠解除過程中的作用提供參考，為種子育苗生產(chǎn)實踐提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用大百合種子，于2015年11月采自云南省哀牢山國家級自然保護(hù)區(qū)（東經(jīng)100°44′～101°30′，北緯 23°36′～24°56′），在 4 ℃ 低溫環(huán)境下儲存?zhèn)溆谩Ｔ谧儨貙臃e結(jié)合激素處理的不同時期，對大百合種子取樣，取樣時間為層積后 0、30、60、90、120、130 d，在各時間點定期取樣，樣品經(jīng)液氮冷凍后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測定種胚發(fā)育過程中植物內(nèi)源激素。

1.2 試驗方法

1.2.1 預(yù)處理方法

以蒸餾水為對照（CK），將大百合種子置于質(zhì)量濃度分別為1、5、10 mg/L的2,4-D溶液中浸泡48 h；每個處理種子150粒，設(shè)置3個重復(fù)。將上述浸種的種子裝入尼龍網(wǎng)袋中，再用潮濕的苔蘚覆蓋網(wǎng)袋，最后放入自封袋中，并在自封袋上用牙簽戳 3～4個小孔以保持透氣性。在恒溫箱中進(jìn)行模擬夏季—秋季—冬季的高溫到低溫的變溫 25 ℃/15 ℃（ 60 d）、15 ℃/5 ℃（ 60 d）、4 ℃（50 d）層積處理，周期性光照（光照12 h，黑暗12 h）。

1.2.2 指標(biāo)測定方法

1）胚長、胚生長率和發(fā)芽率的測定 在變溫層積90、105、120、135 d時，每個處理中隨機抽取10粒種子，在體視顯微鏡（徠卡公司，德國）下沿著與胚平行的方向，測量胚的長度。在變溫層積150 d時，隨機選取100粒，按公式（1）計算胚生長率，共重復(fù)3次。當(dāng)胚根突出珠孔1 mm時，種子視為已萌發(fā)，觀察并記錄種子發(fā)芽起始時間。每隔5 d，統(tǒng)計100粒種子中的發(fā)芽率，并按公式（2）計算。

2）內(nèi)源激素含量的測定 在變溫層積期間，定期對處理組（5 mg/L 2,4-D）和CK浸泡48 h的種子分別取樣，經(jīng)液氮冷凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱中；用液-質(zhì)聯(lián)用色譜儀（安捷倫，美國）測定GA3、生長素（IAA）及脫落酸（ABA）的內(nèi)源激素含量，具體方法參照參考文獻(xiàn)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對種胚長度、胚生長率進(jìn)行單因素ANOVA的Duncan多重比較方法進(jìn)行顯著性差異分析，對內(nèi)源激素ABA、IAA和GA3含量進(jìn)行單樣本T檢驗分析，使用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度2,4-D浸種對大百合種胚長度的影響

由圖1可知，隨著層積時間的增加，不同處理大百合種胚的長度均增長，但在層積90 d時，不同處理間胚長差異不顯著；層積105 d時，CK與5 mg/L 2,4-D處理差異顯著（P＜0.05），與10 mg/L 2,4-D處理差異極顯著（P＜0.01），CK的胚長分別高出5 mg/L 2,4-D和10 mg/L 2,4-D的胚長8.38%、14.74%。層積120 d時，CK與其他處理差異顯著（P＜0.05），與5 mg/L和10 mg/L 2,4-D顯著極差異（P＜0.01），CK的胚長分別高出5 mg/L 2,4-D和10 mg/L 2,4-D的胚長15.28%、15.88%。層積135 d時，CK與5 mg/L 2,4-D處理顯著差異（P＜0.05），5 mg/L 2,4-D處理的胚長高出CK的胚長9.03%。

圖 1 不同濃度2,4-D處理下大百合種胚的長度變化Fig. 1 Length changes of C. giganteum embryos under different concentrations of 2,4-D

2.2 不同濃度2,4-D對大百合種子發(fā)芽的影響

由表1可知，CK的胚生長率與5 mg/L 2,4-D和 10 mg/L 2,4-D差異極顯著（P＜0.01）；5 mg/L 2,4-D處理的胚生長率最高，達(dá)到82%，比CK高出10%；10 mg/L 2,4-D處理的胚生長率最低，為52.33%，比CK低19.67%。5 mg/L 2,4-D的發(fā)芽起始時間最早，為4 ℃下14 d，比CK早11 d。

表 1 大百合種子胚生長率和發(fā)芽時間Table 1 Seed embryo growth rate and germination time of C. giganteum

由圖2可知，1 mg/L 2,4-D處理下，種子發(fā)芽率高于CK 3%，5 mg/L 2,4-D的發(fā)芽率最高，達(dá)75.33%，高于CK 15.33%，可促進(jìn)大百合種子的萌發(fā)；10 mg/L 2,4-D的發(fā)芽率最低，為36.33%，明顯低于CK，低了30%。結(jié)合來看，5 mg/L 2,4-D處理的胚生長百分比最高，發(fā)芽時間最早，發(fā)芽率最高，利于大百合種胚后熟，可以縮短發(fā)芽時間，提高種子萌發(fā)。

圖 2 不同濃度2,4-D處理下大百合種子的發(fā)芽率Fig. 2 Germination rate of C. giganteum seeds treated with 2,4-D with different concentrations

2.3 大百合種子層積過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化

隨著層積時間的增加，在層積過程中，大百合種子ABA、IAA和GA3含量的變化表現(xiàn)出不同的規(guī)律，見圖3。

圖 3 大百合種子層積過程中內(nèi)源激素含量的變化Fig. 3 Variation of endogenous hormones content in the process of C.giganteum seeds stratification

由圖3a可知，在大百合種子層積過程中，CK和2,4-D處理在ABA含量的變化總體呈下降趨勢。在未變溫層積0 d時差異極顯著（P＜0.01），2,4-D處理比 CK高了 14.53 ng/g；在層積30 d時差異極顯著（P＜0.01），2,4-D處理的比CK低了9.55 ng/g；在層積120 d時差異極顯著（P＜0.01），CK比2,4-D低了5.59 ng/g；在層積60、90、130 d時，處理差異不顯著。CK中ABA含量在層積60 d時，下降速度較快，層積30 d相比，降了14.1 ng/g，在層積120 d時達(dá)到最低水平9.82 ng/g；而2,4-D處理的ABA含量在層積30 d時，急速下降，降了31.69 ng/g，在層積60 d時達(dá)到最低水平14.14 ng/g。表明2,4-D 5 mg/L處理的ABA含量下降速度的時間比CK早了30 d，最低水平時間比CK早60 d。

由圖3b可知，大百合種子在層積過程中，CK和2,4-D處理在IAA含量上呈先上升后下降的趨勢，不同的層積時間顯著極差異（P＜0.01）。變溫層積0 d時，IAA含量最低，2,4-D處理比CK高出3.98 ng/g；在層積60 d時，IAA含量達(dá)到峰值，外源2,4-D抑制內(nèi)源IAA，CK高達(dá)1 954.52 ng/g，比2,4-D處理高出516.66 ng/g；層積120 d時，2,4-D處理的IAA含量上升較快，比 CK高出 173.82 ng/g。IAA含量在層積60 d時，上升速度較快，與30 d相比，CK增長了 1 877.49 ng/g，2,4-D處理增長了 947.2 ng/g，層積90 d時，IAA含量急速下降，與60 d相比，CK降低了1 925.39 ng/g，2,4-D處理下降了1 421.02 ng/g。

由圖3c可知，大百合種子在層積過程中，CK和2,4-D處理在GA3含量的水平變化大體上呈先上升后下降的趨勢。除層積130 d時差異顯著（P＜0.05），其他的層積時間顯著極差異（P＜0.01）。在變溫層積0 d時，2,4-D 5 mg/L處理的GA3含量比CK高出9.86 ng/g；GA3含量在層積120 d時達(dá)到峰值，2,4-D處理比CK高出52.17 ng/g，外源2,4-D促進(jìn)內(nèi)源GA3；層積120 d，GA3含量上升速度較快，與90 d相比，CK增長了38.4 ng/g，2,4-D處理增長了99.72 ng/g；層積130 d時，GA3含量急速下降，與120 d相比，CK降低了40.01 ng/g，2,4-D處理下降了96.34 ng/g。

2.4 大百合種子后熟過程中各激素含量之間的比值變化

由圖4可知，大百合種子后熟階段IAA/ABA、GA3/ABA之間的比值變化也存在差異，在層積過程中，IAA/ABA、GA3/ABA之間的比值整體上呈先上升后下降的趨勢。

圖 4 大百合種子層積過程中各激素含量之間的比值變化Fig. 4 Changes in the ratio of hormones during stratification of C. giganteum seeds

從圖4a中可以看出，在層積60 d時，IAA/ABA達(dá)到峰值，CK比2,4-D處理高了49.24；IAA/ABA變化較大，在層積60 d時，上升速度較快，與30 d相比，CK的IAA/ABA增長了148.1，2,4-D處理增長了73.66；層積90 d時，IAA/ABA急速下降，與60 d相比，CK降低了149.47，2,4-D處理下降了100.84；層積120 d時，2,4-D處理的IAA/ABA比CK高出10.53。從圖4b中可以看出，在層積120 d時，GA3/ABA達(dá)到峰值，2,4-D處理比CK高了1.63；GA3/ABA變化較小，在層積120 d時，上升速度較快，與90 d相比，CK的GA3/ABA增長了4.38，2,4-D處理增長了6.47；層積130 d時，GA3/ABA急速下降，與120 d相比，CK降低了4.4，2,4-D處理下降了6.28。IAA/ABA、GA3/ABA上升說明發(fā)芽促進(jìn)物質(zhì)占相對優(yōu)勢，種子向萌發(fā)的方向發(fā)展。

3 結(jié)論與討論

種子休眠是植物經(jīng)過長期的演化而獲得的一種對環(huán)境條件及季節(jié)性變化的生物學(xué)適應(yīng)性[17]。近年來，國際上對形態(tài)生理休眠（MPD）種子的研究已取得了一定的進(jìn)展，但仍被認(rèn)為是種子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中了解最少的休眠類型之一。國內(nèi)對MPD的研究也才剛剛起步，已有的研究僅限于對部分植物的種子形態(tài)和萌發(fā)處理，研究還不深入、缺乏系統(tǒng)性。姚林君等[18]系統(tǒng)總結(jié)了MPD種子的形態(tài)結(jié)構(gòu)、休眠打破的環(huán)境需求、MPD的起源與進(jìn)化以及MPD的植物類群。形態(tài)生理休眠特性在木蘭科植物中非常常見，如西康玉蘭（Magnolia wilsonii）[19]。

馮小芹等[20]研究了98%濃硫酸、高溫處理、機械處理等6種不同種子處理方法對漆樹（Toxicdendro vernicifluum）幼苗生長的影響，本實驗采用變溫層積結(jié)合激素處理對大百合種子休眠解除的影響。張家玲等[21]用2,4-D對滇重樓（Paris polyphylla）種子萌發(fā)進(jìn)行研究，結(jié)果表明90 d時，CK的萌發(fā)率為40.33%，0.4 mg/L 2,4-D浸種處理48 h滇重樓種子萌發(fā)率最高達(dá)53.33%，0.2～0.4 mg/L的 2,4-D可促進(jìn)滇重樓種子的萌發(fā)，而高于0.4 mg/L的2,4-D對種子的萌發(fā)具有抑制作用。大百合種子的休眠類型屬于MPD，本研究采用不同濃度2,4-D處理大百合種子，大百合種子的胚不完全伸長，種子也會萌發(fā)，在層積135 d時，5 mg/L 2,4-D處理的胚長比CK高出9.03%，胚的長度不能衡量種子休眠解除的程度。5 mg/L 2,4-D處理的胚生長百分比最高，達(dá)到82%，發(fā)芽時間最早，為4 ℃下14 d；發(fā)芽率最高，達(dá)75.33%，5 mg/L 2,4-D處理可以縮短發(fā)芽時間，提高種子萌發(fā)，利于大百合種胚后熟。1 mg/L 2,4-D處理促進(jìn)作用不明顯，10 mg/L 2,4-D處理起到明顯的抑制作用。

劉序等[22]采用GC-MS方法分析鑒定了香榧（Torreya grandis）種子的外種皮、內(nèi)種皮和胚乳萃取液中內(nèi)源物種類及其相對含量，本研究采用LC-MS方法測定了大百合種子層積過程中3種內(nèi)源激素。Khan[23]提出種子的休眠和萌發(fā)由3個因子調(diào)節(jié)，即萌發(fā)促進(jìn)物質(zhì)GA3、細(xì)胞分裂素和ABA之間的相互作用決定種子休眠與萌發(fā)。ABA和GA3是調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的一對拮抗內(nèi)源激素，IAA對萌發(fā)沒有明顯的影響，但間接影響種胚的發(fā)育和其他激素水平[24]。大百合種子層積過程中，ABA、IAA和GA3的含量發(fā)生不同規(guī)律的變化。5 mg/L 2,4-D處理的ABA含量在層積30 d時，急速下降，下降速度的時間比CK早了30 d，在層積60 d時達(dá)到最低水平，比CK早60 d。5 mg/L 2,4-D處理的IAA含量和GA3含量在層積的0 d、120 d時，均比CK高。內(nèi)源激素的相對水平對種子休眠具有重要的調(diào)控作用，IAA/ABA在層積60 d達(dá)到峰值，CK比5 mg/L 2,4-D高了49.24，GA3/ABA的比值在層積120 d達(dá)到峰值，5 mg/L 2,4-D處理比CK高了1.63。

大百合種子的休眠并不是單一因素引起的，而是各種激素共同作用的結(jié)果。綜合來看，ABA含量的變化與大百合種胚的發(fā)育呈負(fù)相關(guān)，IAA和GA3可能是促進(jìn)大百合種子休眠解除的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，5 mg/L 2,4-D處理通過抑制ABA而促進(jìn)種胚的萌發(fā)。不同外源GA3處理天女木蘭（Magnolia sieboldii）[25]胚乳中ABA含量隨層積時間大體上呈持續(xù)下降趨勢，GA3含量均在種子休眠解除期（120 d）含量達(dá)到最大，IAA含量呈先升高后下降的趨勢，并均在層積40 d時達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，本研究中與天女木蘭胚乳中內(nèi)源激素含量的變化相似，表明適宜濃度的外源GA3和2,4-D浸種處理有利于種子休眠解除和萌發(fā)。

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