陸文偉，胡文兵，曹文金，楊震南，丁歷偉，楊京梅，陳 衛,*

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.杭州味全食品有限公司，浙江 杭州 310018）

人體腸道是一個極其復雜的微生態系統[1]。在這個微生態系統之中，腸道菌群、營養素以及宿主細胞有著緊密的聯系[2-4]。腸道菌群中本身就含有條件致病菌，一旦腸道菌群失調可能會誘發這類細菌產生毒素或者侵染腸道黏膜，造成系統性的感染[5-6]。另外，腸道菌群的失調也會引起人體對相關營養素的代謝失衡。因此，腸道菌群的失調會給人體健康帶來較大的負面影響[7]。越來越多的研究表明，腸道菌群的失調會引起肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化和腸易激綜合征等疾病[8-10]。

世界衛生組織和聯合國糧食及農業組織定義益生菌是一類活的微生物，攝入足量益生菌會對宿主健康有益[11]。益生菌具有拮抗腸道致病菌，維持腸道內環境穩態，重建失調的腸道菌群以及調節腸道免疫系統等功效[12-15]。最常用于食品的益生菌主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌，且主要來源于發酵制品。酸奶不僅是一類風味良好、營養物質豐富的發酵制品，更是益生菌重要的食物載體。因此，從酸奶中篩選具有優良益生特性的益生菌菌株不僅安全，而且簡單易行，具有十分重要的意義。

益生菌Lactobacillus caseiLC01具有良好的耐酸、耐膽鹽特性，目前已被廣泛用于乳品工業[16]。本研究以小鼠為實驗動物，通過灌胃LC01菌株，結合高通量測序技術分析正常小鼠以及青霉素干預小鼠的腸道菌群差異，評價LC01菌株對小鼠腸道菌群的調節作用，并探討其對小鼠腸道轉運率的影響，為開發LC01菌株作為有益人體健康的益生菌提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級BALB/c雄性小鼠130 只，體質量18～22 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證號：311620400001877，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0006。

Lactobacillus caseiLC01菌株（300億組活菌數為1.25×108CFU/mL；600億組活菌數為2.5×108CFU/mL）購自丹麥科漢森公司。

鹽酸洛哌丁胺膠囊（2 mg/粒，6 粒/盒，批號：161028325） 西安楊森制藥有限公司；注射用青霉素鈉（0.48 g，8×105U/g，批號：20160303） 哈藥集團有限公司獸藥廠；MRS培養基 青島海博生物技術有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設備

GRP-9160型隔水式恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；RC BIOS 10型冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FE-20型pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

采用MRS液體培養基，37 ℃條件下靜置培養LC01菌，生長至穩定前期時，室溫條件下5 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體沉淀用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，加入脫脂乳后凍干成菌粉。菌粉再經蒸餾水復溶后制成5×108CFU/mL菌懸液。

1.3.2 動物分組及處理條件

動物于屏障環境（使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0011）下飼養，室內環境溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%。室內環境保持清潔、安靜，12 h/12 h白天-黑夜循環光照。適應性喂養1 周后，小鼠隨機分為3 個大組（模型1、模型2和模型3），分別用于評價LC01菌對正常小鼠菌群、青霉素處理后小鼠菌群以及便秘模型小鼠腸道轉運的影響。具體分組和處理條件如表1所示，其中300億組、600億組服用LC01的劑量根據人與小鼠的等效劑量系數之算法換算得到，稀釋1.3.1節制備的菌懸液灌胃小鼠。

表1 小鼠分組及處理情況Table 1 Grouping and treatment of mice

1.3.3 小鼠糞便宏基因組的提取

收集模型1和模型2小鼠停止灌胃一周后的小鼠糞便，使用土壤基因組提取試劑盒提取小鼠糞便的宏基因組。具體方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 16S rRNA擴增分析

通過N a n o D r o p 2 0 0 0和瓊脂糖凝膠電泳來評價提取效果，總體顯示提取的基因組D N A濃度和純度都符合進一步建庫要求。使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'），擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4可變區，分析小鼠腸道菌群多樣性。純化后的聚合酶鏈式反應產物等量混合構建測序文庫，使用Illumina的MiSeq測序平臺進行測序。下機數據經過質控過濾得到有效序列用于分析小鼠腸道菌群在分別服用300億活菌和600億活菌的多樣性變化。

1.3.5 小腸推進率的測定

末次給藥0.5 h后，各組小鼠均用墨汁灌胃。0.5 h后立即脫頸處死小鼠，打開腹腔，剪取上端自幽門，下端至回盲腸結點的腸管，置于托盤上，輕拉小腸至直線，測量腸管長度為小腸總長度，幽門至墨汁前沿為墨汁推進長度，按照以下公式計算小腸推進率。

1.4 數據統計分析

實驗數據的差異顯著性采用Graphpad Prism 6.0軟件進行單因素方差分析判斷，P＜0.05視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 LC01菌株對正常小鼠腸道菌群的調節作用

2.1.1 LC01菌株對小鼠腸道菌群組成的影響

圖1 不同LC01菌株劑量對正常小鼠腸道菌群豐度及多樣性的影響Fig. 1 Effect of different doses of LC01 on relative abundance and diversity of intestinal microbiota in normal mice

如圖1所示，正常小鼠灌胃2 周LC01菌株（300億、600億）后，小鼠腸道優勢菌屬（相對豐度大于1%）的結構組成并未發生顯著變化，擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬（Clostridium）、毛螺菌（Lachnospira）、乳桿菌屬（Lactobacillus）依舊為優勢菌群，說明正常小鼠腸道優勢菌屬的組成相對穩定。進一步分析不同組別小鼠腸道菌群的β多樣性來說明LC01菌株對小鼠腸道菌群的影響。

圖2 不同LC01菌株劑量對小鼠腸道菌群結構β多樣性的影響Fig. 2 Effect of different doses of LC01 on β diversity of intestinal microbiota in mice

如圖2所示，相對于空白組，300億組和600億組小鼠腸道微生物菌群的β多樣性具有顯著差異。PCA分析發現，空白組、300億組和600億組小鼠腸道內菌群多樣性均有明顯的聚類現象，說明LC01菌株的灌胃劑量對小鼠腸道菌群結構的影響顯著。

2.1.2 LC01菌株對小鼠腸道菌群不同菌屬相對豐度的影響

圖3 LC01菌株對小鼠腸道菌群不同菌屬相對豐度的影響Fig. 3 Effect of LC01 on relative abundance of intestinal microbiota at the genus level

在菌群分析的基礎上，進一步比較各個處理組小鼠腸道菌群中不同菌屬相對豐度的變化。結果如圖3所示，相對于空白組的（2.90±1.34）%，300億和600億組中的Lactobacillus屬相對豐度均有顯著增加，分別提高至（14.22±13.24）%（P＜0.05）和（22.85±9.34）%（P＜0.001），說明LC01菌株可以顯著增加小鼠腸道內乳桿菌的相對豐度。乳桿菌屬不同菌種具有顯著的益生效果，包括抑制致病菌，改善腸道菌群結構，增強機體免疫功能，改善血脂，減輕乳糖消化不良癥狀，抗氧化等功效[17-20]。同時發現，活菌組的Bacteroides和Bacteroides S24-7屬豐度顯著增加（P＜0.05），而同為擬桿菌門的Odoribacter屬豐度則極顯著降低（P＜0.01)。相對于空白組，活菌組的毛螺菌科未定菌屬豐度顯著降低（P＜0.05），而梭菌目未定菌屬和Rikenellaceae未定菌屬則均無統計學上的差異（P＞0.05）。此外，600億組Prevotella屬相對豐度顯著降低，由空白組的（3.97±1.37）%降低至（0.99±0.78）%（P＜0.001），提示LC01菌株的細胞組份可以顯著地抑制小鼠腸道內Prevotella屬的增殖，并且菌量越高，其抑制效果越明顯。研究發現Prevotella屬是臨床上較常見的一種條件致病菌，在促炎環境中很旺盛，并在風濕性關節炎中扮演著關鍵的角色[21-22]。LC01株的細胞組分可以顯著降低小鼠腸道中Prevotella屬的相對豐度，具有潛在緩解風濕性關節炎的作用。活菌組Helicobacter屬的相對豐度顯著降低，由空白組的（3.00±1.89）%降低至300億組的（1.12±1.01）%（P＜0.01）和600億組的（0.82±0.42）%（P＜0.001），表明LC01菌株可以顯著降低小鼠腸道中Helicobacter屬的相對豐度。Helicobacter屬是人體條件致病菌，可引起慢性腸炎和胃癌等疾病，提示LC01菌株可能具有預防慢性腸炎和胃癌的功效。

2.2 LC01菌株對青霉素導致的腸道菌群失調的影響

2.2.1 LC01菌株顯著改善青霉素導致的腸道菌群失調

腸道菌群失調可導致眾多疾病，包括慢性代謝疾病、肝臟疾病和腸道疾病等[23]。因此，改善腸道菌群失調可營造良好的腸道環境，有利于維護人體健康。本研究利用青霉素構建腸道菌群失調小鼠模型，通過比較模型組和活菌組糞便中菌群豐度及多樣性變化，評價LC01菌株對青霉素導致的小鼠腸道菌群失調的改善作用。

圖4 不同LC01菌株劑量對青霉素引起的小鼠腸道菌群豐度變化的恢復作用差異Fig. 4 Effect of different doses of LC01 on changes in relative abundance of intestinal microbiota in penicillin-treated mice

如圖4所示，相對于模型組，青霉素菌群失調小鼠灌胃兩周LC01菌株（300億或者600億）后，腸道優勢菌屬擬桿菌屬、梭菌屬的相對豐度顯著恢復，乳桿菌屬的相對豐度則顯著增加，且600億組的效果優于300億組。該研究結果表明LC01菌株有助于改善青霉素所致失調菌群，提示LC01在調節菌群失調方面具有一定潛力。

2.2.2 LC01菌株對青霉素干預小鼠腸道菌群不同菌屬相對豐度的影響

如圖5所示，與模型組相比，服用LC01菌株實驗組的Lactobacillus屬相對豐度均有所增加，300億組可以基本恢復到青霉素處理前的水平，而600億組則可以顯著增加乳桿菌相對豐度，由模型組的（0.62±0.19）%提高至（9.92±3.25）%（P＜0.001）。同時，活菌組的梭菌目和毛螺菌科未定菌屬的相對豐度均顯著增加（P＜0.05）。梭菌目和毛螺菌科未定菌屬代謝所產生的丁酸對腸癌具有顯著的預防作用[24-26]，提示LC01菌株可通過調節梭菌目和毛螺菌科未定菌的豐度來預防腸癌的發生。另外，600億組極顯著恢復了瘤胃菌科未定菌屬以及Bacteroides屬的豐度（P＜0.01)，并顯著降低Prevotella屬、Helicobacter屬、Rikenellaceae未定菌屬（Alistipes屬為其代表性屬）和Parabacteroides屬豐度。其中，600 億活菌的Prevotella屬和Helicobacter屬豐度降低最為顯著（P＜0.001）。綜上結果表明，LC01菌株可顯著恢復青霉素引起的小鼠腸道中Lactobacillus屬，梭菌目、毛螺菌科和瘤胃菌科未定菌屬相對豐度異常，同時降低條件性致病菌Prevotella屬、Helicobacter屬、Rikenellaceae未定菌屬的相對豐度，對青霉素引起的小鼠腸道菌群失調具有顯著的改善作用。

圖5 青霉素建模后LC01菌株恢復和正常恢復小鼠腸道菌群屬水平豐度差異分析Fig. 5 Variation analysis of relative abundance of intestinal microbiota between the LC01 treatment group and the control group at the genus level

2.2.3 LC01菌株對小鼠腸道轉運的影響

便秘是一種常見的功能性胃腸道疾病，也是許多高死亡率疾病的誘發因素，已嚴重影響了人們的身體健康和生活質量[27-28]。研究表明，益生菌能夠有效地緩解小鼠便秘，提示其在緩解便秘方面具有較大的潛力[29-30]。洛哌丁胺是一種阿片受體激動劑，可作用于腸壁阻止乙酰膽堿和前列腺素的釋放，導致腸道蠕動的減緩，因而常用于便秘模型的造模[30]。本研究利用洛哌丁胺構建便秘小鼠模型，通過比較模型組和活菌組的排便數量、排便質量以及腸道推進率，評價LC01菌株對便秘小鼠腸道轉運的影響。

圖6 LC01菌株對小鼠腸道轉運的影響Fig. 6 Effect of LC01 on intestinal peristalsis in mice

由圖6可知，在洛哌丁胺干預后，模型組5 h內的排便數量、排便質量和腸道推進率分別為（1.6±1.0）粒、（25.4±17.3）g和（44.1±7.2）%，與空白組的（16.4±3.4）粒、（132.4±36.4）g和（57.22±4.60）%均有高度顯著差異（P＜0.001），說明造模成功。在LC01干預組中，5 h內的排便數量由模型組的（1.6±1.0）粒增加到300億組的（4.6±1.7）粒和600億組的（80.0±2.9）粒；排便質量由模型組的（25.4±17.3）g增加到300億組的（55.0±19.8）g和600億組的（82.0±16.9）g；腸道推進速率由模型組的（44.1±7.2）%恢復到300億組的（50.6±4.2）%和600億組的（55.2±4.1）%。上述結果表明，LC01菌株可以顯著提高小鼠腸道的推進速率，增加排便數量和質量，從而有效緩解便秘。

3 結 論

本實驗探究了干酪乳桿菌LC01菌株對小鼠腸道菌群和腸道轉運的影響。結果發現，LC01菌株可明顯提高正常小鼠腸道中Lactobacillus屬和Bacteroides屬的相對豐度，降低條件性致病菌Prevotella屬、Helicobacter屬的相對豐度，對小鼠腸道菌群具有顯著的調節作用。另外，LC01菌株能夠顯著改善青霉素所致腸道菌群失調，并可促進洛哌丁胺引起的腸道轉運速率緩慢癥狀的恢復。綜上，LC01菌株對小鼠腸道菌群具有一定的調節作用，并且對腸道轉運有著良好的促進作用，說明LC01菌株具有潛在的益生作用，有利于腸道健康。