周斯儀，鐘賽意,2,3,*，蘇偉明,3，杜振興，陳建平，洪鵬志，章超樺,3,4

（1.廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518108；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；3.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；4.廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江 524088）

魚鰾也稱魚泡、魚肚或魚膠等，是魚類調節沉浮的器官。魚鰾富含膠原蛋白、多糖等活性物質，自北魏《齊民要術》開始記載以來，一直被視為藥食兩用的滋補珍品。《本草綱目》記載魚鰾有止血作用，可用來治療吐血、崩漏、外傷出血和產后抽搐等[1]。《本草新編》稱魚鰾具有養肝益腎、補腎固精的功效[2]。魚鰾還能滋養經脈、散瘀消腫[3]。但其作用功效和物質基礎仍不明確。目前對魚鰾功能因子研究主要集中在其膠原蛋白和多肽的提取、結構表征及生物活性等方面[4-6]。近幾年有報道發現魚鰾多糖具有預防結腸癌、緩解胃潰瘍、系統性紅斑狼瘡炎癥的潛力[7-9]，但目前對魚鰾多糖的組成和結構特性尚未明確。本課題組前期研究發現魚鰾多糖以糖胺聚糖為主[10]，并進一步發現其主要由類肝素化合物組成。

肝素是由糖醛酸與葡萄糖胺組成的聚陰離子黏多糖，作為高效的抗凝血藥物廣泛應用于臨床治療。隨著藥理學的發展，發現肝素還具有抗血栓、抑制平滑肌細胞增生、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性，但其較高的抗凝血作用容易引起出血副作用，因而限制了其在非抗凝方面的應用[11]。類肝素是結構上與肝素結構相似的一類酸性黏多糖，常見的有硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）和硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）等。類肝素抗凝血作用相對較低，長期使用無肝素抗凝血活性引起的副作用。因此類肝素化合物越來越多地引起研究者關注。本研究采用酶法提取魚鰾類肝素（heparinoid from swimming bladder，HSB），并對其進行分離純化和結構鑒定，以期為闡明魚鰾多糖的結構組成和構效關系提供參考，為魚鰾功效因子的進一步開發與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚鰾（鱸魚，Lateolabrax japonicus）購自湛江市霞山水產品批發市場；2709堿性蛋白酶（1.2×105U/g）南寧龐博生物工程有限公司；FPA98 Cl型大孔陰離子交換樹脂 羅門哈斯（中國）公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-2,4-dihydro-3H-pyrazol-3-one，PMP）、CS二糖標準品（ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純）德國Meker公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

N-1300D-WB型旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社；HR/T20MM型高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；FD8508型真空冷凍干燥機 韓國ilShin公司；Xevo G2-XS QTof高分辨質譜（mass spectrometry，MS）儀 美國Waters公司；Agilent1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統 美國安捷倫公司；Bruker AV-500和AV-700超導核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國Bruker BioSpin GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 HSB的制備與分離

參考文獻[11]中肝素的制備工藝并略作調整，工藝流程為：魚鰾干粉→酶解→滅酶→離心取上清液→大孔陰離子交換樹脂吸附洗脫→醇沉→離心收集沉淀→無水乙醇洗滌2 次→透析→冷凍干燥。

具體步驟：魚鰾經烘干、粉碎后，加入20 倍體積的雙蒸水和質量濃度為5.4 mg/mL的蛋白酶，50 ℃水浴鍋中酶解20 h；沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心（8 000 r/min、20 min）；取上清液用大孔陰離子交換樹脂進行動態吸附，再分別用0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化鈉溶液進行梯度洗脫；每分鐘收集一管，用阿利新藍法分析管中類肝素含量，以收集管數為橫坐標、阿利新藍法染色所得吸光度（A490nm）為縱坐標制作梯度洗脫曲線；收集洗脫液，緩慢加入1 倍體積的無水乙醇，靜置12 h后離心（4 000 r/min、5 min），收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2 次；經3 kDa透析袋脫鹽，冷凍干燥。

1.3.2 基本成分質量分數和HSB得率的測定

類肝素質量分數測定采用阿利新藍法[12]，以肝素為標準品；蛋白質量分數測定采用福林-酚法[13]，以牛血清白蛋白為標準品；糖醛酸質量分數測定采用咔唑-硫酸法[14]，以葡萄糖醛酸為標準品；氨基己糖質量分數測定采用改進的Wagner法[15]，以葡萄糖胺為標準品；硫酸基質量分數測定采用BaCl2-gel比濁法[16]，以硫酸鉀為標準品。HSB得率和各成分質量分數分別按式（1）、（2）計算。

式中：md1為HSB質量/mg；md2為魚鰾干粉質量/g。

式中：ρ為某成分質量濃度/（mg/mL）；md3為所稱取HSB質量/mg；V為溶液體積/mL。

1.3.3 HSB的種類鑒定

類肝素化合物的結構鑒定采用醋酸纖維素薄膜電泳法，具體步驟參考文獻[17]。

1.3.4 HSB的純度分析

HSB用蒸餾水配成1 mg/mL的溶液，以蒸餾水為調零管，采用紫外-可見分光光度計測定樣品的紫外吸收光譜。

1.3.5 HSB的分子質量分析

采用高效凝膠色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測定HSB的分子質量[18]。色譜柱：Ultrahydrogel Column 500糖分析凝膠柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：0.2 mol/L硫酸鈉；流速：0.6 mL/min；檢測器為1200示差檢測器；進樣體積：10 μL。

葡聚糖標準品（分子質量分別為10 000、23 800、48 600、80 000、150 000、273 000、409 800 u）和HSB分別用0.2 mol/L硫酸鈉溶液配制成質量濃度為5 mg/mL的溶液，經0.22 μm的針式濾膜過濾后進樣。記錄標準品和樣品的保留時間并進行數據處理。

1.3.6 HSB的單糖組成分析

樣品前處理：稱取樣品3.0 mg于15 mL樣品瓶中，加入1.5 mol/L的三氟乙酸9 mL，置于110 ℃烘箱中分別水解2、4、6、8、12、16、24、28 h，水解液用氮氣吹干，蒸干物用超純水溶解，并于－20 ℃下保存備用。

處理后的樣品和單糖標準品采用PMP衍生-高效液相反相色譜法測定[19]。單糖標準品：甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA）、N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）、半乳糖（galactose，Gal）。色譜柱：ZORBAX EclipseXDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）-乙腈溶液（83∶17，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm；進樣體積：10 μL。

1.3.7 HSB結構的FTIR分析

取2.0 mg樣品，在紅外燈下烘烤2 h，然后放入瑪瑙研鉢中，加入100 倍質量的以同樣方式處理的氯化鉀，混合均勻，研磨至顆粒小于2.5 μm，放入壓片機中加壓制成半透明的小薄片；再將其放入傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrophotometer，FTIR）掃描儀中進行光譜掃描，掃描范圍為4 000～400 cm－1。

1.3.8 HSB的二糖組成分析

二糖組成分析參考文獻[20]的方法并稍作修改。精密稱取0.010 0 g多糖樣品，加入5 mL醋酸銨緩沖液（pH 7.6～8.0，含0.2 U CS酶ABC），37 ℃孵育24 h。沸水浴滅酶5 min，10 000 r/min離心25 min。上清液用3 kDa超濾離心管過濾，取濾液冷凍干燥。將處理后的樣品和CS二糖標準品（ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S）分別用超純水配成1 μg/mL溶液用于MS/MS分析。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.9 HSB結構的NMR分析

HSB樣品溶于D2O中，冷凍干燥，反復3 次以置換出H2O。處理后的樣品用D2O配制成30 mg/mL的溶液，在常溫下用NMR儀進行1H譜、13C譜、異核單量子相干（heteronuclear singleqauntum coherence，HSQC）譜和異核多鍵相關（heteronuclear multiple-bond correlation，HMBC）譜分析。

1.4 數據分析

所有實驗重復3 次，結果以平均值±標準偏差表示，采用Origin 9.1和ChemBioDraw Ultra軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HSB的分離結果

圖1 類肝素化合物FPA98 Cl型大孔陰離子交換柱洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of heparinoids on FPA98 Cl column

類肝素為聚陰離子酸性黏多糖，在組織中以糖蛋白的形式存在。因此，類肝素的提取以酶法為主，蛋白酶將糖蛋白中的蛋白質分解成易于去除的小肽和氨基酸，使類肝素從中釋放出來。游離在酶解液中的類肝素經FPA98 Cl型大孔陰離子交換樹脂動態吸附，再用氯化鈉溶液梯度洗脫，使中性多糖、蛋白質和多肽等雜質被低濃度的氯化鈉溶液洗脫下來，帶陰離子基團較多的類肝素則被高濃度氯化鈉溶液洗脫下來。梯度洗脫結果圖1所示，0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化鈉溶液分離出的洗脫液經醇沉、透析、冷凍干燥后，得到4 個組分：F1、F2、F3和F4。各洗脫組分的得率和基本成分質量分數見表1。

表1 各洗脫組分的HSB得率與基本成分Table 1 Yield and composition of each elution fraction

由表1可知，從組分F1到F4，類肝素、糖醛酸和氨基己糖質量分數逐漸升高，蛋白質量分數遞減，說明該方法能將類肝素高效分離出來。組分F4的HSB得率最高，為（2.21±0.03）mg/g，F2次之；組分F1蛋白質質量分數最高，HSB得率和類肝素質量分數都很低，且檢測不到糖醛酸和氨基己糖，說明組分F1可能為中性糖和蛋白質的混合物，梯度洗脫曲線中該組分吸光度高可能受色素、蛋白質等雜質的影響。組分F4的硫酸基質量分數最高，為（12.29±2.20）%，F3次之，其他組分未檢測到硫酸基。硫酸基質量分數是提示類肝素活性的一項重要指標，一定范圍內硫酸基的質量分數越高，生物活性越強[21]。Sayari等[17]用海鰲蝦殼提取的類肝素中硫酸基質量分數高達（23.00±0.03）%，具有較強的抗凝血和抗細胞增殖作用。

2.2 HSB的種類鑒定結果

圖2 各洗脫組分及標準品的醋酸纖維素薄膜電泳結果Fig. 2 Acetate cellulose electrophoresis of each elution fraction and glycosaminoglycan standard

不同種類的糖胺聚糖之間存在電荷密度差異，在醋酸纖維素薄膜電泳中表現出不同的遷移率。各洗脫組分醋酸纖維素薄膜電泳結果如圖2a所示，組分F1為單一條帶，遷移率最低，這與其基本成分分析相符，進一步驗證F1可能是中性糖；組分F2和F3有4 個條帶，說明所含糖胺聚糖種類較多；組分F4為單一條帶，遷移率最大。結合各組分HSB得率和理化性質分析，選擇類肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基質量分數最高、蛋白質量分數低、醋酸纖維素薄膜電泳條帶單一的組分F4做進一步結構鑒定。

醋酸纖維素薄膜電泳操作簡易、靈敏度高，可作為初步鑒別糖胺聚糖種類的方法。在吡啶-甲酸緩沖液（pH 3.0）中，相對遷移率從小到大依次為透明質酸、硫酸角質素、DS、CS和肝素[20]。由圖2b可知，肝素因電荷密度最高，遷移率最大；其次分別是CS、DS。組分F4的條帶與CS遷移率相近，初步確認組分F4為CS。

2.3 組分F4的純度及分子質量

2.3.1 紫外光譜掃描結果

圖3 組分F4紫外光譜圖Fig. 3 Ultraviolet absorption spectrum of F4

紫外光譜掃描是評價類肝素純度的方法之一。類肝素在185～220 nm處有糖基末端的吸收峰[8]，核酸和蛋白質分別在260、280 nm處有特征吸收峰。由圖3可知，紫外光譜掃描結果顯示，組分F4除在204 nm處有糖基末端吸收峰外，在其他紫外區域無明顯吸收峰；結合2.1節組分F4的蛋白質量分數為（0.19±0.07）%，表明F4純度較高。

2.3.2 HPGPC分析結果

圖4 組分F4的HPGPC圖譜Fig. 4 High performance gel permeation chromatogram of F4

由圖4可知，組分F4的HPGPC圖只出現1 個峰，且峰形較對稱，表明F4的質量分布相對均一，純度較高。高效凝膠色譜與示差折光檢測器聯用測得葡聚糖的分子質量的對數（y）與保留時間（x）的回歸方程為：y＝－0.319 2x＋9.429 0（R2＝0.996 6），計算得出組分F4的分子質量約為84 000 u。一般類肝素的分子質量在5 000～40 000 u范圍之間[22]，相比之下，組分F4的分子質量較大。

2.4 組分F4的單糖組成分析結果

糖胺聚糖由特定的重復二糖單位構成，根據二糖組成的差異，分為透明質酸、HS、肝素、DS和CS。因此，可以根據單糖組成推測類肝素黏多糖的種類。對比單糖混標的HPLC圖譜（圖5）發現，組分F4單糖衍生物（水解時間8 h）的HPLC圖（圖6）中出現1 個峰值很高的未知峰。由圖7可知，隨著組分F4水解時間的延長，未知峰的峰面積比例減少，GlcA和IdoA的峰面積比例也逐漸減少，GalNAc的峰面積比例不斷升高，說明未知峰可能是未降解的寡糖片段。另外，也有報道稱此處為未降解完全的寡糖片段[23]。這可能是由于半乳糖胺較難水解，有研究表明半乳糖胺比其他單糖需要更長的時間才能完全被降解[19,24]。糖醛酸在酸溶液中不穩定，易發生脫羧反應，甚至會被強酸完全分解[25]，因此隨降解時間的延長糖醛酸的峰面積比例降低。根據保留時間和峰面積比例得出，組分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal，由此得出其主鏈可能是CS。

圖5 混合標準品單糖衍生物的HPLC圖譜Fig. 5 High performance liquid chromatogram of mixture of monosaccharide derivative standards

圖6 組分F4單糖衍生物的HPLC圖譜Fig. 6 High performance liquid chromatogram of monosaccharide derivatives from F4

圖7 水解時間對組分F4降解產物峰面積比例的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis time on percentage peak areas of degradation products from F4

2.5 組分F4結構的FTIR分析結果

圖8 組分F4和CS的FTIR圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectra of both F4 and CS

由圖8可知，組分F4的FTIR圖與CS標準品基本一致。3 421 cm－1處出現強而寬的峰是O—H和N—H伸縮振動，說明組分F4存在分子間和分子內的氫鍵[26]；2 918 cm－1處的吸收峰表明存在亞甲基[27]；1 646 cm－1處強而稍寬的峰是乙酰氨基中的C＝O對稱伸縮振動產生的，另外，1 557 cm－1處N—H變角振動峰和1 419 cm－1處C—N伸縮振動峰表明存在乙酰氨基[28-29]；1 377 cm－1處的峰是—COO－中的C＝O對稱伸縮振動產生的[27]；1 234 cm－1處不太尖銳的峰可能是C—H變角振動；1 255 cm－1處硫酸基中的S＝O伸縮振動和852 cm－1處硫酸酯基中的C—O—S軸向伸縮振動表明存在硫酸基團[35]；927 cm－1處的吸收峰是吡喃糖環的非對稱伸縮振動產生的[30]。

根據二糖單位中硫酸基數量和鏈接位置的不同，CS分為A、C、D、E等種類。A型CS（CSA）的硫酸基在C4位，產生的軸向伸縮振動峰在850 cm－1附近；C型CS（CSC）的硫酸基在C6位，硫酸基處于平位，吸收峰在820 cm－1附近[31]。本實驗所用CS標準品為E型CS（CSE），在820 cm－1和850 cm－1附近均有吸收峰。組分F4只在850 cm－1附近有吸收峰，表明F4可能為CSA或其衍生物。

2.6 組分F4的二糖組成分析結果

根據以上結果得出組分F4中主要含CS。為進一步分析組分F4的二糖組成，采用CS酶ABC將CS完全裂解成不飽和二糖，再經MS/MS分析鑒定。根據硫酸基團數量及鏈接位置，CS二糖分為ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S等。其中，ΔDi-4S是CSA的主要二糖單位，ΔDi-6S是CSC的主要二糖單位。此外，由于具有相同硫酸基團數量的二糖相對分子質量相同，不能通過準離子峰區分開，因此通過二級質譜的碎片離子進行區分。組分F4完全降解產物和4 種常見的CS二糖標準品的MS/MS結果如圖9所示。

圖9 組分F4裂解產物和二糖標準品的MS/MS圖Fig. 9 MS/MS spectra of degraded products of F4 and disaccharide standards

圖10 CS二糖碎片基本組成圖[32-33]Fig. 10 Basic composition of chondroitin sulfate disaccharide fragments[32-33]

圖10 為CS二糖碎片的基本組成[32-33]。結合圖10和表2可知，ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S的半乳糖胺不含硫酸基，特征碎片結構是[Z1－2H]－，m/z為202.09；ΔDi-UA-2S的硫酸基連接在葡萄糖醛酸C2的羥基上，因此具有[Y2－H]－和[Z2＋Na－H]－特征碎片結構，其m/z分別為236.99、276.98。ΔDi-4S和ΔDi-6S的區別體現在，ΔDi-4S在m/z282處的離子相對豐度小于m/z300或不存在，而ΔDi-6S在m/z300處的離子相對豐度小于m/z282或不存在[34]。圖9中ΔDi-4S在m/z300.06處的離子相對豐度大于m/z282.05，ΔDi-6S在m/z282.05處的離子相對豐度較大，在m/z300.06處沒有碎片峰。此外，還觀察到ΔDi-6S在m/z239.94處的特征峰，其結構為[W1－H]－，可用來判斷是否存在ΔDi-6S。組分F4完全降解產物的質譜圖中，在m/z202.09、236.99、276.98處沒有碎片峰，表明組分F4不含ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S；在m/z300.06處的離子相對豐度大于m/z282.05，且不含ΔDi-6S特征峰m/z239.94，說明F4的主要二糖單位為ΔDi-4S。結合FTIR掃描結果，確定組分F4主要為CSA。

表2 二糖MS/MS特征碎片峰及其結構Table 2 MS/MS characteristic fragment peaks of disaccharides and their structures of disaccharides

2.7 組分F4結構的NMR鑒定結果

圖11為組分F4的1H、13C、HSQC和HMBC的NMR譜圖。在1H NMR譜圖中，質子信號最強的峰位于δ4.79處，是氘代水產生的溶劑峰，除此之外，所有質子信號均位于2 個光譜區。在δ2.0～2.1之間出現了乙酰胺甲基信號，文獻[35]報道CSA和CSC的乙酰胺甲基信號分別在δ2.04、2.02處，組分F4乙酰胺甲基信號位于δ2.04，說明F4可能為CSA；其他質子信號集中在δ3～5之間，說明F4為β-構型[36]。

圖11 組分F4的NMR 圖譜Fig. 11 NMR spectraof F4

在13C NMR譜圖中，δ174.96和δ174.35的低場信號表明存在乙酰氨基和己糖醛酸的羧基；δ22.45的高場信號可能為乙酰胺甲基碳；其他信號集中在δ50～105之間。此外，由HSQC譜圖中的（2.04，22.47）和HMBC譜圖（2.04，174.38）確定δ22.47為乙酰氨基的甲基碳信號，δ2.04為乙酰氨基的甲基質子信號，δ174.38為乙酰氨基的羰基碳信號。參照文獻[35]和[37]對組分F4的1H、13C NMR譜進行歸屬，結果如表3所示。對1H、13C、HSQC和HMBC圖譜進行綜合分析，得出組分F4主要結構式為[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n。

表3 組分F4的1、13C NMR信號歸屬Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

表3 組分F4的1、13C NMR信號歸屬Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

信號歸屬 1 2 3 4 C-5 6 NAc-1 NAc-2 GlcA-H 4.47 3.38 3.59 3.79 3.67 GlcA-C 103.39 72.07 73.34 80.19 76.27 174.96 GalNAc-H 4.57 4.03 4.02 4.75 3.84 3.79 2.04 GalNAc-C 100.65 51.25 75.35 76.23 74.23 60.73 174.38 22.47

3 結 論

本研究以魚鰾為原料，采用酶法提取類肝素，通過陰離子交換樹脂和醇沉進行分離純化，制備出得率較高、結構相對均一的類肝素組分F4，其得率為（2.21±0.03）mg/g，類肝素質量分數為（85.79±0.63）%。紫外光譜和HPGPC結果表明組分F4純度較高；分子質量分布相對集中，約為84 000 u。通過柱前衍生-HPLC得出組分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal。組分F4的FTIR譜圖和二糖組成與CSA一致，結合NMR分析得出組分F4主要結構式為[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n，屬于CSA。CSA具有免疫調節[38]、抗炎[39]、抗氧化[40]和抗腫瘤[41]等活性，主要用于預防骨關節炎、冠心病、神經痛及角膜炎等疾病[11]。本研究可為進一步分析魚鰾功能及其作用機理、提高魚鰾的利用價值提供參考。