膠凍樣類芽孢桿菌菌粉的研制及功能菌株的存活性研究*

張愛民，李乃康，曹丹丹，張璐琳

(1.河北大學生物技術研究中心 河北保定 071051； 2.河北大學生命科學學院 河北保定 071051； 3.蘇州工業(yè)園區(qū)報關有限公司 江蘇蘇州 215000)

膠凍樣類芽孢桿菌是一種能夠分解硅酸鹽礦物的細菌，因此一些學者將其稱為硅酸鹽細菌。由于該菌株具有分解鉀長石、云母等鋁硅鹽類原生質(zhì)態(tài)礦物的能力，使土壤中的不溶性K、P、Si等轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄栽毓┲参锢茫瑫r還可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)以促進植物生長，因而其在農(nóng)業(yè)上獲得了廣泛應用。除此之外，該菌株還廣泛應用于采礦、冶金、制藥等領域[1]。

以膠凍樣類芽孢桿菌為出發(fā)菌株，可以研制出應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的微生物菌劑，但由于該菌株發(fā)酵有效活菌數(shù)低，致使在實際應用中的接種數(shù)量與其他農(nóng)用微生物菌株相差較大，限制了該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用[2]。河北大學生物技術研究中心的技術人員創(chuàng)造性地采用現(xiàn)代生物分離技術，利用膠凍樣類芽孢桿菌內(nèi)生芽孢具有耐高溫、高壓、干燥、氧化等不良因素的特性，采用噴霧干燥工藝研制出高含量膠凍樣類芽孢桿菌菌粉制劑[3]。

隨著我國現(xiàn)代高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展，要求肥料的研制向有機-無機-生物方向發(fā)展，其中關鍵因素是耐高滲透壓微生物菌株的篩選，以便更好地與化學肥料協(xié)同作用。筆者研究了將膠凍樣類芽孢桿菌菌粉與化肥及草炭配伍研制出復合微生物肥料及功能膠凍樣類芽孢桿菌菌株的存活情況，為膠凍樣類芽孢桿菌菌粉肥料制劑在化肥工業(yè)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)菌種：膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)HB- 02，河北大學農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)保實驗室保存。

(2)其他原料：草炭(165 μm/100目)，河北滿城國興草炭加工廠；化學肥料，購自河北農(nóng)業(yè)大學科技市場。

(3)檢測培養(yǎng)基：蔗糖5.000 g，Na2HPO4·12H2O 2.000 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g，CaCO30.100 g，瓊脂18.000～20.000 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.5～8.0。

1.2 主要儀器和設備

LPR300噴霧干燥機，無錫聞華干燥設備有限公司；DHC- 500型碟片式離心機，遼陽市制藥機械廠；BN0203型電子天平，上海民僑精密科學儀器有限公司；DH- 500型恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HZQ- F160型恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；LDZF- 50KB型全自動滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；UB100i型顯微鏡，重慶UOP光電技術有限公司。

1.3 方法

(1)菌落和菌體形態(tài)特征

取培養(yǎng)12 h膠凍樣類芽孢桿菌的斜面，無菌操作涂片，經(jīng)革蘭氏染色后觀察其菌體形態(tài)；同時在斜面中加入一定量的無菌水，涂布于檢測培養(yǎng)基上，于32 ℃倒置培養(yǎng)36 h，觀察其菌落形態(tài)。

(2)有效活菌數(shù)的測定及芽孢收率的計算

從發(fā)酵終點的膠凍樣類芽孢桿菌發(fā)酵液中吸取5.0 mL于45.0 mL無菌水中，按1∶10進行梯度稀釋，得到10-1，10-2，10-3，10-4……稀釋度的菌懸液；每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，均勻地涂布于檢測培養(yǎng)基平板上；每一稀釋度重復3次，同時以無菌水作空白對照，于32 ℃培養(yǎng)48 h，以出現(xiàn)20～300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標準，統(tǒng)計有效活菌數(shù)。

芽孢收率為噴霧干燥后得到產(chǎn)品的生物量與噴霧干燥前生物量的比值，按式(1)計算：

(1)

(3)發(fā)酵液的濃縮處理技術

膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株在20 m3發(fā)酵罐發(fā)酵到終點的發(fā)酵液采用碟片式離心機進行濃縮處理，為下一步發(fā)酵液的噴霧干燥處理提供準備。

(4)進風溫度對芽孢生物量及收率的影響

設定噴霧干燥塔的進風溫度分別為110、130、150和170 ℃，干燥后進行芽孢收率的測定，進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥的理想進風溫度。

(5)通風量對芽孢生物量及收率的影響

設定噴霧干燥塔的通風量分別為10、15、20以及25 m3/min，干燥后進行芽孢收率的測定，進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥最適宜的通風量。

(6)進料速率對芽孢生物量及收率的影響

設定噴霧干燥塔的進料速率分別為0.50、0.75和1.00 t/h，干燥后進行芽孢收率的測定，進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥較為理想的進料速率。

(7)3批次發(fā)酵液噴霧干燥結(jié)果

采用20 m3發(fā)酵罐進行了3批次試驗，裝料體積占發(fā)酵罐總?cè)莘e的65%。發(fā)酵結(jié)束后，首先進行離心濃縮，然后加入填充劑，再進行噴霧干燥，最后測定其芽孢收率及有效活菌數(shù)。

(8)HB- 02菌株在不同復合微生物肥料中的存活率

從河北農(nóng)業(yè)大學科技市場購買的氮肥、磷肥及鉀肥按一定質(zhì)量比與草炭及保護劑混合后，得到不同N、P2O5、K2O含量及有機質(zhì)含量的有機-無機混合物，然后加入40.0 g通過上述噴霧干燥工藝研制的高含量膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株菌粉(50.0×108cfu/g)，制成不同N- P2O5- K2O含量的復合微生物肥料。試驗共設T1、T2、T3、T4和T55個處理，每個處理樣品質(zhì)量為500.0 g，3次重復，分別裝入無菌聚丙烯袋中密封常溫保存，在不同時間取樣測定膠凍樣類芽孢桿菌的有效活菌數(shù)。T1、T2、T3、T4和T5的N、P2O5和K2O含量如下：T1，w(N+P2O5+K2O)=0%；T2，w(N+P2O5+K2O)=8%；T3，w(N+P2O5+K2O)=15%；T4，w(N+P2O5+K2O)=25%；T5，w(N+P2O5+K2O)=30%。

2 結(jié)果和討論

2.1 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落和菌體形態(tài)特征

如圖1所示，在檢測培養(yǎng)基上，膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落表面光滑，邊緣整齊，無色透明，濕潤有光澤，隆起，質(zhì)地黏稠，有彈性，挑起時可拉成絲。

圖1 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落形態(tài)

圖2 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌體形態(tài)

如圖2所示：培養(yǎng)12 h的膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株經(jīng)革蘭氏染色以后，菌體呈粗長桿狀，末端圓形，大小為(1.0～1.8) μm×(3.0～7.0) μm，革蘭氏染色陰性，菌體中常有1～2個大脂肪顆粒；培養(yǎng)后期在菌體中形成芽孢，芽孢處于中央或亞中央，橢圓形，大小為(1.5～2.0) μm×(2.0～3.5) μm，胞囊膨大后不成梭形；在營養(yǎng)貧乏時，菌體外包有2～4層橢圓形肥大莢膜，大小為(15.0～20.0) μm×(20.0～35.0) μm，而在營養(yǎng)豐富時形成的莢膜較小或不形成莢膜。

2.2 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液的濃縮處理

發(fā)酵液濃縮處理的目的在于縮短噴霧干燥后的處理時間，減輕后處理壓力，以便得到高含菌量的菌粉產(chǎn)品。當膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株到達發(fā)酵終點后，首先將發(fā)酵液轉(zhuǎn)至儲罐，然后選用DHC- 500型碟片式離心機進行離心濃縮，在得到的濃縮液中加入一定量的環(huán)糊精(目的是減輕濃縮液在噴霧干燥過程中的黏壁現(xiàn)象)后，進入噴霧干燥塔進行氣流干燥處理。

2.3 進風溫度對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

首先設定膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液噴霧干燥的進料速率為0.5 t/h，通風量為15 m3/min。在該條件下，將進風溫度分別設定為110、130、150和170 ℃，通過LPR- 300型噴霧干燥機進行干燥處理。通過3批次試驗表明：進風溫度為110～130 ℃時，黏壁現(xiàn)象嚴重，不易收集成品；進風溫度為170 ℃時，黏壁現(xiàn)象輕微，成品呈粉末狀；進風溫度為150 ℃時，能收集到粉末狀的成品，存在輕微的黏壁現(xiàn)象，樣品含水量低，菌粉的收集率在85%以上。因此，確定噴霧干燥處理的理想進風溫度為150 ℃。

2.4 通風量對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

噴霧干燥處理時，膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液在進料速率為0.5 t/h、進風溫度為150 ℃的條件下，通風量分別設定為10、15、20和25 m3/min，通過LPR- 300型噴霧干燥機進行干燥處理。試驗表明：在通風量較低(10～15 m3/min)的情況下，黏壁現(xiàn)象嚴重；在通風量較高(25 m3/min)的情況下，不利于菌粉的收集；在通風量為20 m3/min條件下，集粉率較高，也不黏壁，菌粉收集率在85%以上。因此，確定噴霧干燥處理的理想通風量為20 m3/min。

2.5 進料速率對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

首先設定膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液噴霧干燥的進風溫度為150 ℃，通風量為15 m3/min。在該條件下，進料速率分別為0.50、0.75和1.00 t/h，通過LPR- 300型噴霧干燥機進行進料干燥處理。試驗表明：進料速率為0.50 t/h時，會使霧滴變小，噴出的霧滴過細、過輕，由于負壓渦旋作用而導致霧滴黏在噴頭上；進料速率為1.00 t/h時，單位時間內(nèi)單位料液水分的蒸發(fā)量降低，霧滴變大，導致無法完全干燥霧滴，樣品的含水量較高，容易堵塞噴頭，掛壁現(xiàn)象嚴重，影響了產(chǎn)品的集粉率。因此，選擇進料速率為0.75 t/h。

2.6 3批次膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液噴霧干燥處理結(jié)果

采用20 m3發(fā)酵罐進行了3批次試驗，裝料體積占發(fā)酵罐總?cè)莘e的65%。發(fā)酵結(jié)束后，首先進行離心濃縮，然后加入填充劑，再進行噴霧干燥。噴霧干燥的工藝參數(shù)為進料速率0.75 t/h、通風量20 m3/min、進風溫度150 ℃，此條件下3批次發(fā)酵液噴霧干燥后菌粉的檢測結(jié)果如表1所示。

表1 3批次發(fā)酵液噴霧干燥后菌粉的檢測結(jié)果

項目批次1批次2批次3平均發(fā)酵液體積/L13 65012 87013 56013 360有效菌含量/(×108,cfu/mL)12.012.511.612.0離心漿液體積/L1 2301 2251 3001 251含菌量/(×108,cfu/mL)118.3117.5108.2114.5收率/%88.889.589.489.2噴霧干燥菌粉質(zhì)量/t503.0471.4504.9493.1有效菌含量/(×108,cfu/g)265.4273.7256.4265.1平均收率/%81.580.282.381.3

從表1可知，在進料速率0.75 t/h、通風量為20 m3/min、進風溫度150 ℃條件下，3批次膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液噴霧干燥的平均收率為81.3%，平均有效活菌數(shù)達到265.1×108cfu/g。

在上述高濃度膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株菌粉中添加一定比例的輔料可以研制出含菌量為50.0×108cfu/g或100.0×108cfu/g的農(nóng)用微生物肥料制劑菌粉，該制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以直接作為肥料使用，也可作為生產(chǎn)微生物菌劑、復合微生物肥料或生物有機肥的菌粉原料。

2.7 膠凍樣類芽孢桿菌在不同復合微生物肥料中的存活性

通過上述方法制備的膠凍樣類芽孢桿菌菌粉與不同復合肥復配研制出復合微生物肥料并在室溫下保存，然后分別在第0、22、56、78和120 d時取樣，采用平板法測定膠凍樣類芽孢桿菌有效菌含量，該菌株在不同復合微生物肥料中的有效活菌數(shù)的變化如圖3所示。

圖3中處理T1、T2、T3、T4、T5的w(N+P2O5+K2O)分別為0%、8%、15%、25%和30%，5個處理的復合微生物肥料在室溫下保存，隨保存時間的延長，膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)均呈下降趨勢，但在120 d內(nèi)下降量較小，其中T5的有效活菌數(shù)從起始的4.53×108cfu/g降至120 d的3.17×108cfu/g，存活率為89.8%；但從120 d 保存至170 d，除T1外，其他各處理的復合微生物肥料膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)均呈現(xiàn)直線下降。根據(jù)該試驗結(jié)果，可確定所研制出的復合微生物肥料的保質(zhì)期應不超過120 d。

圖3 膠凍樣類芽孢桿菌在不同復合微生物肥料中的有效活菌數(shù)的變化

農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準《復合微生物肥料》(NY/T 798—2015)中規(guī)定粉劑復合微生物肥料標準保質(zhì)期為不低于3個月，w(N+P2O5+K2O)不超過25%。該試驗結(jié)果不僅提高了農(nóng)業(yè)行業(yè)標準中復合微生物肥料中w(N+P2O5+K2O)不超過25%的規(guī)定，保障了農(nóng)作物營養(yǎng)需求，而且延長了保存期，為復合微生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實際應用提供了有力保證[4]。

通過方差分析進一步研究復合微生物肥料中N、P2O5、K2O含量和保存時間對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 方差分析結(jié)果

源平方和自由度均方F值P(顯著性)時間1 808.0895361.61811.9440.000濃度171.044442.7611.4120.237誤差2 422.0228030.275總計119 892.00090

從表2可知：由于P時間=0.000<0.050。可知復合微生物肥料保存時間對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響達到顯著差異水平；而P濃度=0.237>0.05，說明復合微生物肥料的N、P2O5和K2O含量對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響未達到顯著性差異。

3 結(jié)語

膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵達到終點后，首先將發(fā)酵液轉(zhuǎn)至儲罐，然后進行離心處理，通過離心濃縮和噴霧干燥研制出高含量菌粉，該菌株最佳噴霧干燥條件為進料速率0.75 t/h、通風量20 m3/min、進風溫度150 ℃。通過對3批次膠凍樣類芽孢桿菌生物量的測定，在該工藝條件下芽孢平均收率在81.3%，平均有效菌數(shù)為265.1×108cfu/g。

w(N+P2O5+K2O)分別為0%、8%、15%、25%和30%的含膠凍樣類芽孢桿菌復合微生物肥料于室溫下保存，隨保存時間的延長，其有效活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，但在120 d內(nèi)有效活菌數(shù)下降量較小，存活率基本在90.0%左右；但當保存時間從120 d延長至170 d，除不含化肥的處理外，其余各處理的有效活菌數(shù)均呈直線下降。依據(jù)試驗結(jié)果，確定所研制出的復合微生物肥料的保質(zhì)期為不超過120 d。

通過試驗研究，為膠凍樣類芽孢桿菌菌粉的工業(yè)化原料生產(chǎn)及復合微生物肥料的研制及保存提供了理論依據(jù)，但其在農(nóng)業(yè)上的應用效果試驗有待研究。