抗人類免疫缺陷病毒1型廣譜中和抗體的研究進展

張子凌，劉明斌，徐建青，張曉燕

復旦大學附屬公共衛生臨床中心，上海 201508

據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)統計，目前全世界大約有 3 700 萬人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者。抗反轉錄病毒療法能夠顯著延長感染者的壽命。然而，從發現HIV至今，艾滋病仍無法治愈。20世紀末，在一些處于慢性感染期的HIV感染者體內發現了一種能中和多種不同類型HIV病毒株的抗體，稱為廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibody，bNAb)[1]。這些體內產生了廣譜中和抗體的感染者表現出更強控制病毒載量的能力[2]。因此，人體免疫系統產生HIV廣譜中和抗體的保護機制及其誘導策略值得深入探索。

1 HIV廣譜中和抗體的保護機制

HIV主要感染CD4+T細胞與單核-巨噬細胞，還能將自身基因組通過反轉錄整合到宿主基因組。潛伏感染的病毒及基因高度變異的病毒可逃脫宿主免疫，在病毒長期慢性感染過程中，部分患者體內變異的病毒抗原持續刺激宿主而逐漸產生廣譜中和抗體，這些個體中病毒滴度可得到良好控制，從而顯著延長感染者的存活期。

HIV表面約有10個由gp160組成的三聚體蛋白，在各類病毒中屬于較少的，從而增加了抗體的識別難度[3]。目前已有的廣譜中和抗體通常通過結合HIV表面gp160蛋白來捕獲病毒，同時可通過病毒膜上的脂質或糖類以增強對病毒的鎖定[3]。由于突變的積累，廣譜中和抗體末端的互補決定區3(complementarity determining region 3，CDR3)比普通抗體長，廣譜性增加，但突變也可能導致抗體不穩定[3-4]，這是廣譜中和抗體面對變異迅速的HIV仍具有良好的控制病毒載量的原因之一。捕獲病毒后，廣譜中和抗體可通過自身介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、調理作用及激活補體等效應來調動免疫系統完成對病毒的清除。相比其他小分子化合物，廣譜中和抗體的優勢在于它能廣泛、特異性地結合并中和不同類型HIV，具有更強的抗病毒能力。因此，廣譜中和抗體不僅能結合抗原，發揮結合抗體的抗病毒效應，還能通過IgG Fc片段發揮ADCC作用而參與抗病毒免疫反應[5]。

2 HIV廣譜中和抗體的研發策略

2.1 抗原表位

大多數HIV廣譜中和抗體主要針對HIV唯一暴露的表面抗原，即花苞狀的包膜蛋白(gp120和gp41)，從而在病毒入侵宿主細胞過程中發揮作用。目前，主要通過構建HIV表面包膜蛋白三聚體來誘導廣譜中和抗體[6]，而包膜蛋白三聚體的結構往往是決定廣譜中和抗體能否有效發揮作用的關鍵，現已發現多個可能誘導廣譜中和抗體的靶點。

表1列出了一些HIV廣譜中和抗體，并根據其結合位點進行了分類。這些靶點包括HIV gp120與CD4受體、CCR4協同受體、CXCR4協同受體的結合位點，gp120可變區V1、V2、V3的結合位點，以及gp41的一些結合位點[7-8]。 如針對HIV包膜蛋白的廣譜中和抗體PGT121、10E8正在進行Ⅰ期臨床試驗[9-10]，N6正在進行Ⅱ期臨床試驗[11]。到目前為止，全世界只有一個抗HIV抗體被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準通過[12]。2018年3月7日，FDA正式批準HIV抗體ibalizumab-uiyk/TMB-355 (商品名：Trogarzo)上市，這是世界上首個被FDA批準通過的抗HIV抗體，針對CD4受體，阻止HIV與CD4受體結合[13]。目前有很多廣譜中和抗體被開發并進行臨床試驗，其他一些HIV治療抗體也在進一步評估和探討中[11,14]。

表1 HIV廣譜中和抗體分類

Tab.1 Classification of HIV bNAbs

NameBreath(%)IC50(μg/mL)ReferenceCD4bindingsite B1235-752.821,15,16 HJ16368.011,17 VRC0188-930.091,18 CH103>50NA19 N6980.0920V1/V2 PG977-830.081,21 PGT145780.2922Glycan-V32G1228-391.451,23PGT121700.031,24PGT128720.021,25MPER 2F555-671.441,20,26 4E1085-1001.621,26 10E898-990.251,27 Z1335401,28

2.2 影響廣譜中和抗體產生的因素

影響廣譜中和抗體產生的因素包括宿主因素和病毒因素。在宿主方面，目前僅知廣譜中和抗體與慢性感染和重復感染有關。有一項研究分析能產生與不能產生廣譜中和抗體的HIV感染者，發現能產生廣譜中和抗體的個體可上調RAB11FIP5，且在NK細胞中表達最高，但機制尚不清楚[29]。對病毒方面了解甚少，但觀察到某些毒株可引起不同個體產生類似的廣譜中和抗體，這對研發能誘導機體產生廣譜中和抗體的HIV疫苗十分重要，但尚未篩選到相關病毒[30]。

2.3 誘導機制及免疫策略

抗病毒抗體研究中，早期一般通過向實驗動物注射抗原誘導體液免疫再分離血清而篩選獲得目標抗體。這種方法并不能支撐廣譜中和抗體的篩選，尤其是全人源的廣譜中和抗體。現在通常采用建立基因庫的方法進行表達，從B細胞中將輕鏈和重鏈基因克隆出來，使用的B細胞可以是從天然感染人群中篩選的，也可以使用病毒樣顆粒等手段在實驗動物或健康人體內誘導。而對于HIV廣譜中和抗體，研究人員最初是在天然感染者中發現并分離篩選到了能表達廣譜中和抗體的B細胞。目前，主要通過免疫誘導方式來篩選廣譜中和抗體。

研究人員在臨床上觀察到一個HIV感染者可能攜帶多種不同毒株，由此設想初始免疫不一定能引發足夠強的或足夠廣譜的免疫反應來應對不同毒株的感染[31]。雖然目前沒有任何證據表明中和能力和中和寬度與初始免疫和重復感染的時間間隔有關，但病毒攜帶兩種及以上病毒的時間間隔與中和寬度有關[32]。這些發現啟發了科研人員使用序貫免疫方法來開發廣譜中和抗體。按照一定的次序使用多種抗原對實驗對象進行免疫，誘導廣譜中和抗體并進行篩選，可使研究人員不再過度依賴天然感染者進行實驗，從而加快了廣譜中和抗體的研究進程[33]。在序貫免疫用于廣譜中和抗體誘導之前，研究人員嘗試了各種誘導廣譜中和抗體的方法，希望找到針對保守表位的抗體，如使用能產生HIV包膜蛋白的DNA質粒、不能復制的缺陷HIV顆粒、病毒樣顆粒構建三聚體蛋白，以及使用佐劑來誘導廣譜中和抗體，但都失敗了[34]。有一項采用序貫免疫策略的研究，利用不同HIV毒株的病毒樣顆粒來誘導廣譜中和抗體，在實驗動物體內表現出較強的免疫反應，連續接種后動物體內的抗體水平不斷增加，且在多種不用HIV亞型連續接種的動物體內產生了更強大的廣譜中和抗體反應[35]。雖然序貫免疫表現出了優異的誘導廣譜中和抗體的能力，但動物實驗與臨床試驗之間存在本質性的差別，實驗動物水平研制出的抗體在人源化后仍存在不確定性。此外，目前從大量抗體中篩選高效廣譜中和抗體與篩選各種小分子化合物藥物一樣，成本高且遙遙無期。隨著生物信息學的發展，未來通過計算機模擬來優化篩選過程以提高篩選的準確性，制訂最優化的免疫順序，大大降低序貫免疫的成本，才是序貫免疫未來發展的趨勢。

2.4 評價體系

確定廣譜中和抗體是否研制成功，建立穩定、適宜的抗體效能評價方法十分重要。恒河猴是猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染的天然宿主，疾病進程與人感染HIV-1相似的，可在一定程度上反映慢病毒感染后宿主的免疫應答特征。采用SHIV(SIV骨架與HIV-1包膜蛋白的嵌合病毒)建立的恒河猴感染模型，可誘導針對HIV-1包膜蛋白的體液免疫應答，對HIV-1疫苗研發更具有借鑒意義。針對HIV-1膜蛋白的中和抗體假病毒評價體系，應覆蓋國際通用序列(NIH AIDS Reagent Program提供的全球通用的12個HIV-1包膜蛋白參考序列克隆)，并覆蓋地域特異性流行性毒株，以評價HIV-1中和抗體的強度與廣度。具體評價指標主要為抗體的保護能力，即抗體與病毒的結合能力和中和能力。在VRC01廣譜中和抗體測試中，研究人員采用了稱為“抗體介導預防”(antibody-mediated prevention，AMP)的方法，直接給測試對象注射抗體來觀察抗體的保護作用，以代替傳統的使用抗原誘導主動免疫的方法[36]。這個理念正逐漸被接受。

2.5 分離方法

篩選廣譜中和抗體的一個重要前提是獲得足夠多的可供篩選的實驗樣本，同時有足夠準確的篩選方法將不能中和的抗體剔除，以減少假陽性。目前，廣譜中和抗體的篩選方法主要有4種：噬菌體展示技術、B細胞永生化技術、單個B細胞培養直接功能篩選、抗體特異性的單個B細胞篩選。

2.5.1 噬菌體展示技術噬菌體展示技術是一種將外源蛋白質的編碼序列整合到噬菌體基因組中，以融合蛋白的方式表達于噬菌體表面的一種技術。其原理是將一段外源目的基因插入噬菌體中一個編碼特定外膜蛋白的基因中，使噬菌體的外殼膜蛋白能與外源DNA所編碼的蛋白形成融合蛋白，展示在噬菌體表面。該技術可在很大程度上將目的基因表達在噬菌體外殼膜蛋白的表面，并保持原有的結構和生物學活性，還可獲得全人源單克隆抗體，減少甚至消除抗體在體內的排異反應。其局限性在于產生的抗體多樣性取決于噬菌體文庫的來源、多樣性和篩選過程[37]。

2.5.2 B細胞永生化技術1977年，研究者采用Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus)來介導轉化記憶B細胞，但效率非常低，很難得到大量抗原特異的B細胞[38]。2004年，研究者在轉化過程中加入多克隆抗體激動劑，轉化效率大幅提升。該技術可使用少量細胞對抗體進行篩選，且篩選到的細胞可直接進行培養和增殖，以產生人源化的廣譜中和抗體。相比噬菌體展示技術，B細胞永生化技術篩選抗體通量更大，工作量更小，成本更低。早期的B12廣譜中和抗體就是使用該方法篩選的[39]。

2.5.3 基于單個B細胞培養技術的篩選單個B細胞培養技術是近10年來抗體領域最常用的技術之一。其技術路線是將記憶B細胞單個分入96孔板，對每個孔單獨進行中和測試，挑選陽性孔行單細胞反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，測序，分離抗體，測試抗體的中和能力。該技術可根據不同需求分為隨機單個B細胞篩選和抗體特異的單個B細胞篩選。其優勢在于保留了抗體可變區的天然配對，基因多樣性得到了保存，需要的細胞數量少，篩選效率高，可產生全人源抗體。但對設備要求相對較高，需流式細胞儀，尤其是進行大規模篩選時。近年來，一些廣譜中和抗體如PG9和VRC01就是通過這種方法篩選獲得的[40]。

3 最新進展

2017年，一篇發表于ScienceImmunology的研究開發了一種針對gp41的高效廣譜中和抗體10E8，能中和98%的HIV毒株，具有很好的開發潛力[41]。2018年，陳志偉等通過構建串聯雙價廣譜中和抗體，獲得一種潛在的能預防和治療艾滋病的單克隆抗體[42]。他們發現，通過保留親本廣譜中和抗體的2個單鏈可變片段結合域，能有效提升中和寬度和效力，并在人源化小鼠中得到有效驗證[42]。

4 結語

廣譜中和抗體的廣譜性意味著能中和盡可能多的毒株，但在提升廣譜性的同時出現共同抗原的概率大大增加，無形中給廣譜中和抗體的研發增加了難度。雖然目前尚無研究表明廣譜中和抗體能徹底清除體內HIV，但能幫助控制艾滋病的發展，有效降低患者體內病毒載量，這一具體機制尚未闡明[13]。由于廣譜中和抗體研制成本高，容易產生逃逸，至今難以用于臨床。近年來，隨著測序成本的降低及相關抗體生產技術的成熟，廣譜中和抗體的研發成本越來越低。此外，通過生物信息學方法對產生廣譜中和抗體的相關患者進行轉錄組分析，也許能破解廣譜中和抗體產生之謎。

許多新技術的出現為HIV治療提供了新的思路和新的工具。如RNA熒光原位雜交(RNA fluorescenceinsituhybridization，RNA-FISH)可在細胞水平結合蛋白檢測mRNA，了解CD4+T細胞與HIV博弈過程中哪些mRNA處于活躍狀態，從而更加深刻地理解HIV感染過程和廣譜中和抗體誘導過程[43]。近年來，一直非常引人注目的基因編輯技術CRISPR和腫瘤領域非常熱門的CAR-T技術引起了HIV治療領域的關注。有一項旨在清除體內病毒庫的CRISDPR研究設計了能廣泛識別HIV保守序列的CRISPR系統[44]。

目前采用單一手段治愈艾滋病存在極大的挑戰，多種策略聯合應用將成為主流。希望全球各國政府及疫苗研發企業能共同合作，增加艾滋病研究領域所需的經費投入與政策支持，以期在全球范圍特別是在貧困地區更好地控制艾滋病疫情。