乙型肝炎病毒共價鍵閉環DNA的表觀遺傳調控研究進展

葉菲，張欣欣，于德敏

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院， 上海 200025

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染仍然是威脅全球人類生命健康的重要危險因素[1]。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者人數超過2.5億，因HBV感染造成的CHB患者發展成為纖維化、肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌等終末期肝病或者其他嚴重并發癥而死亡的人數每年高達100萬[2]。目前，治療CHB的抗病毒藥物主要有干擾素和核苷(酸)類似物兩大類，它們能抑制HBV的復制，有效控制CHB患者病情的進一步發展[3-4]。但是上述兩類藥物對HBV共價閉合環狀DNA(HBV cccDNA)卻無直接清除作用，故患者需要長期服藥以抑制病毒復制，防止出現治療后停藥復發[5]。作為DNA病毒，HBV具有獨特的反轉錄病毒復制模式。既往的研究已證明HBV cccDNA可與組蛋白及非組蛋白(如HBc、HBx宿主轉錄因子)等相結合，以微染色體(minichromosome)形式存在于肝細胞核中[6-7]，其半衰期較長，為HBV的轉錄和復制提供原始模板，可以轉錄出病毒所有mRNA，其中3.5 kb產物為HBV前基因組RNA(pgRNA)，能翻譯出HBV衣殼蛋白及P蛋白。pgRNA 5′端具有ε莖-環結構，P蛋白與該莖-環結構結合后衣殼蛋白開始包繞pgRNA使其衣殼化，同時P蛋白的反轉錄酶結構域以pgRNA為模板合成全長的基因組負鏈DNA，隨后以負鏈DNA為模板合成正鏈DNA，新形成的松弛環狀DNA(rcDNA)與病毒表面蛋白組裝成完整的HBV顆粒后釋放至細胞外，完成復制周期[8]。

近年來的研究表明，表觀遺傳(epigenetic)調控基因表達機制在HBV cccDNA的持續存在和轉錄調控及HBV的持續感染等方面發揮著重要作用。表觀遺傳學不涉及任何可遺傳DNA序列的直接改變,但會發生基因功能的可遺傳改變，其調控機制有多種，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA干擾(non-coding RNA)和染色質重塑[9]。目前認為宿主因素和HBV自身抗原均可以參加cccDNA的表觀遺傳調控過程。本文就當前相關研究的最新進展進行綜述。

1 HBV cccDNA甲基化

DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)催化，把一個甲基轉移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG島長度大約為 1 000 個堿基對(bp),比基因組其余區域有更多CpG序列的一段DNA，啟動子區域附近的CpG島DNA甲基化形成的5mC可以干擾轉錄因子對DNA的識別和結合，進而影響pgRNA的轉錄和減少病毒DNA的復制[10]。

有研究證明，HBV基因組中至少存在6個CpG島[11]，研究較為詳細的包括3個重要區域：CpG島1與S基因的起始位點重疊，CpG島2包含增強子Ⅰ和Ⅹ基因啟動子，CpG島3與Sp1啟動子和P基因的起始密碼子重疊。其中CpG島2位于增強子Ⅱ/核心基因啟動子的上游，是HBV cccDNA轉錄的關鍵調控區域[12]。另有實驗報道從55例HBeAg陽性CHB患者的肝臟活檢組織中提取HBV cccDNA，并對其CpG島2甲基化狀態和數量進行分析，結果表明HBeAg陽性患者肝細胞中cccDNA甲基化水平明顯低于HBeAg陰性患者，HBeAg陽性患者cccDNA甲基化陽性標本中rcDNA與cccDNA的比值也顯著低于cccDNA甲基化陰性標本，提示cccDNA的甲基化對HBV的轉錄和復制具有負向調控作用[13]。HBc與HBV DNA結合可減小核蛋白復合物的核小體間距，從而有利于HBV cccDNA轉錄調控[6]。HBc與HBV cccDNA結合發生在調控HBV轉錄的重要區域CpG島2，HBc與CpG島2的相對比例和HBV DNA水平及rcDNA/cccDNA的比值都呈正相關，同時HBc與乙酰轉移酶CREB結合蛋白(CBP)正相關而與組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)負相關， CBP和HDAC1是組蛋白H3/H4乙酰化的關鍵調控因子。上述結果說明HBc Ag與CpG島2的結合抑制了DNA甲基化。研究者進一步推測是HBc與CBP或HDAC1的相互作用，誘導組蛋白乙酰化，進而抑制CpG島的甲基化，表明HBc對HBV cccDNA的轉錄發揮了正向調控作用[14]。

在HBV感染的人肝細胞中，DNMTs表達活性上調，導致HBV cccDNA甲基化[12-13]。另有實驗證明，野生型HBx可上調DNMTs酶活性和水平，而在HBx缺失的HBV突變穩定細胞株中未有此效果，表明HBx有可能作為HBV cccDNA復制的正向調控因子，誘導HBV cccDNA甲基化[15-16]。已證實cccDNA負調控元件(negative regulatory element，NRE)可以調控核心啟動子的轉錄，一種NRE結合蛋白(NREBP)的抑制因子可與NRE的特定位點結合，抑制pgRNA的合成[17]。近期的實驗發現HBx通過使HBV NRE結合位點的C-1619的甲基化，阻斷NREBP作用，核心啟動子激活，病毒基因組轉錄和復制增加，進一步闡述了HBx在HBV cccDNA復制中詳細機制[18]。

2 組蛋白修飾對HBV cccDNA的表觀調控

組蛋白的翻譯后修飾(post-translational modification, PTM)包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，這些修飾參與調控基因的表達。細胞采用一系列復雜而精確的酶，包括組蛋白乙酰轉移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDAC)、賴氨酸甲基轉移酶(KMTs)和去甲基化酶(KDMs)、激酶和磷酸酶、泛素連接酶和去泛素化酶等，增加和去除這些修飾，從而介導對HBV cccDNA的表觀遺傳調控。

既往研究證實，HBV cccDNA結合的組蛋白H3上第4、36或79位賴氨酸的三甲基化(H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3)，H3K9、H3K7和H3K122的乙酰化(H3K9ac、H3K27ac、H3K122ac)以及H4上第3位精氨酸不對稱的二甲基化(H4R3me2a)都能促進基因轉錄；而H3K9的二甲基化(H3K9me2)或三甲基化(H3K9me3)、H3K27的三甲基化(H3K27me3)與H4R3對稱二甲基化(4R3me2a)能抑制基因轉錄[19-20]。同時發現乙酰轉移酶p300和CBP以及Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶HDAC1被招募到HBV cccDNA微染色體上[20]。

在HBV的生命周期中，HBx的表達會介導細胞信號轉導、轉錄、增殖和DNA的修復、表觀調控、凋亡等多重細胞功能的改變。有報道證實HBx與HBV cccDNA招募上述與組蛋白乙酰化有關的酶(如p300、PCAF/GCN5及HDAC1、hSirt1等)密切相關[7,21]，而cccDNA結合H3/H4組蛋白乙酰化的狀態對HBV的復制和轉錄產生影響[7]。研究人員觀察到，當HBx缺失時，組蛋白3(H3)結合的cccDNA乙酰化明顯減少，H3第4位賴氨酸三甲基化(H3K4me3)減少，H3第9位賴氨酸二甲基化和三甲基化(H3K9me2、H3K9me3)增加[22]。而H3第9位賴氨酸上的甲基化(H3K9me)可能與基因沉默相關，由含SETDB1在內的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(histone lysine methyltransferases, HKMT)所介導[23-24]。HBV感染后，SETDB1 能通過H3K9me3和HP1所介導調控染色質結構的細胞機制導致HBV cccDNA轉錄沉默，而HBx恢復存在時，HBV則正常轉錄[22,25]。SETDB1酶有利于維持cccDNA微染色質被抑制的狀態。近期研究者通過shRNA敲低SETDB1 mRNA(shSETDB1)，特異性減少SETDB1蛋白的表達水平；在轉染48h前用shSETDB1處理后的細胞中，病毒顆粒DNA水平明顯增加，結果表明SETDB1能負向調控HBV的轉錄，這種負向調控是由組蛋白賴氨酸去甲基化酶-1(LSD1)和組蛋白甲基轉移酶SET1A所介導，進一步試驗發現，當HBx缺失時細胞中LSD未能激活cccDNA的H3K9去甲基化，SET1A也未能激活H3K4的甲基化，形成被抑制的cccDNA染色質狀態。上述結果再次證明HBx對HBV cccDNA轉錄活性的重要性[25]。最新的研究利用HBV感染系統模型證明SIRT3可以介導HBV cccDNA的轉錄。SIRT3是組蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族一員，SIRT3被招募到HBV cccDNA上，使cccDNA結合的組蛋白3第9位賴氨酸(H3K9)去乙酰化，增加組蛋白甲基化轉移酶SUV39H1的募集，減少SETD1A的募集。同時SIRT3也通過降低RNA酶聚合酶Ⅱ和轉錄因子YY1與cccDNA的結合調控HBV的復制。而HBX可以通過抑制SIRT3的表達，減輕SIRT3介導的cccDNA轉錄抑制作用[26]。此外，在組蛋白泛素化方面，HBx與損傷特異性DNA結合蛋白1(damage-specific DNA-binding protein1，DDB1)、Cullin4-ROC1環E3泛素連接酶(CRL4)的相互作用對HBV cccDNA基因組的轉錄有調控作用[27]。研究人員利用蛋白組學實驗鑒定染色體(SMC)復雜蛋白SMC5和SMC6能作為HBx的靶點，使CRL4-HBx-E3連接酶進行泛素化，從而抑制HBV cccDNA的轉錄[28]。

有研究證實HBc是HBV cccDNA微染色體的組成成分之一，且參與HBV轉錄的表觀調控。HBc通過與cccDNA的結合，減少cccDNA-組蛋白復合物的核糖體間距來調節HBV轉錄[6,20]。近期研究確定了HBc可以調控cccDNA轉錄的特定區域，研究人員在HBc C端(CTD)的4個富含精氨酸區域進行多種突變，然后檢測HBc突變株對HBV DNA、RNA、HBsAg水平的變化，最終確定HBc-CTD 突變株區域Ⅲ、Ⅳ可能通過減少HBc與cccDNA 間的相互作用，同時減少與cccDNA相結合組蛋白的乙酰化作用，調控HBV的轉錄[29]。PRMT5是蛋白精氨酸甲基轉移酶,研究者通過siRNA干擾方法將PRMT5敲低，檢測到胞內pgRNA和核心顆粒DNA增加，而在細胞上清液中HBeAg、HBeAg表達水平降低；將PRMT5過表達后胞內pgRNA和核心顆粒DNA降低，而在細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達水平增加。進一步研究發現PRMT5能優先結合cccDNA，并引發微染色體結合的組蛋白H4上第3位精氨酸對稱二甲基化(H4R3me2s)，抑制cccDNA的轉錄，但在組蛋白H3上卻沒有檢測到類似結果。另外PRMT5還可能與反轉錄酶的H區域相結合，阻礙其與病毒聚合酶蛋白的相互作用，干擾pgRNA的核衣殼包裝。以上研究提示PRMT5通過表觀遺傳抑制HBV cccDNA轉錄和干擾pgRNA包裝[30]。

3 非編碼RNA對HBV cccDNA的表觀調控

非編碼RNA是指不編碼蛋白質的RNA，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA 等多種已知功能的RNA。miRNA是其中一種小型、高度保守的小分子，長度一般為22個核苷酸左右，能在轉錄后水平調控相關基因的表達，通過與靶序列特異性配對結合，形成基因沉默復合物，促進該基因的降解或直接抑制該基因復制[31]。研究表明，miRNA在表觀調控網絡中對HBV cccDNA轉錄發揮著關鍵作用[32]，可通過調控宿主免疫或非免疫基因的表達，對HBV復制起到間接調控作用，或者結合于HBV各種轉錄產物進行直接調控。一方面，在基因表達的不同水平，表觀遺傳修飾酶和ncRNAs都能進行多功能調控，并且兩者能夠相互作用，體現基因表達調控的復雜性和精準性。許多重要的表觀遺傳調控因子能被miRNA轉錄后調控，比如miRNA-152和miRNA-148的下調導致DNA(胞嘧啶-5)甲基轉移酶1(DNMT1)的上調[33]。此外，組蛋白修飾酶的改變也參與miRNA調控過程。有報道miRNA-125b和miRNA-29能分別靶向調控組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶SUV39H1和SETDB1，以此調控細胞基因的表達[34]。另一方面，ncRNA也屬于表觀遺傳修飾的調控因子，有許多ncRNA被證明能招募表觀遺傳因子來介導基因組特定位點的表觀遺傳修飾。例如，H19、HOTTIP、lncBRM和lncTCF7都已被證明能夠招募WDR5/MLL、CBP/P300、核小體重構復合物SWI-SNF等基因激活因子，激活特定基因的表達[35-37]。

HBx是調控HBV復制的必需蛋白，有研究者通過染色質免疫沉淀測序(ChIP-Seq)發現了HBx調控cccDNA轉錄和HBV復制的機制與miRNA有關，HBx通過抑制miRNA-138、miRNA-224和miRNA-596的表達，緩解了miRNA對HBV pgRNA轉錄的抑制作用[38]。另有研究表明，miRNA-101能被HBx下調，且靶向定位于DNA甲基轉移酶3A，使其DNA甲基化異常，可能與HBx介導的表觀遺傳調控所致肝癌發生的機制相關[39]。血清HBV水平與miRNA-192-3p呈負相關，HBx顯著降低了miRNA-192-3p啟動子活性和內源性miRNA-192-3p水平，但HBx缺失突變株未能抑制miRNA-192-3p的表達，而miRNA-192-3p能通過抑制HBV誘導的自噬信號通路，最終調節HBV在宿主細胞中的復制[40]。

HBV自身蛋白HBc通過與HBV cccDNA結合或刺激HBV增強子活性正向調控HBV轉錄。有研究表明，miRNA-548家族成員可能在調節免疫應答，尤其在一些干擾素應答方面起關鍵作用[41]。在最近的一項研究中，研究人員通過生物信息學分析顯示組蛋白乙酰化酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)可能是miRNA-548ab的候選基因靶點之一。將miRNA-548ab過表達和敲低后，分別在3種肝癌細胞系和注射腺病毒HBV載體的小鼠模型中進行實驗，結果表明miRNA-548ab的表達與HDAC4的表達呈負相關。進一步通過熒光qPCR檢測cccDNA的表達水平，發現miRNA-548ab可以靶向HDAC4，抑制cccDNA結合的組蛋白H3的去乙酰化，從而正向調控HBV cccDNA的復制。HBc能增強miRNA-548ab在肝細胞中的表達，miRNA-548ab對HBV詳細作用機制還有待進一步探究[42]。HBV編碼的miRNA(HBV-miRNA-3)位于HBV基因組核苷酸373～393位，能通過外泌體和成熟病毒顆粒釋放至細胞外，抑制HBsAg、HBeAg的表達和HBV的復制。為深入探究HBV-miRNA-3抑制HBV復制機制，通過生物信息學技術預測HBV-miRNA-3的作用靶點，實驗證明HBV-miRNA-3靶向作用于HBV 3.5 kb mRNA(核苷酸1815～2452)，從而特異性降低pgRNA的水平[43]。

4 染色質重塑

染色質結構的高度動態變化在基因轉錄沉默和激活過程中起重要作用。一方面，核小體折疊形成結構緊密的高級結構——30nm染色質纖維，導致基因沉默；另一方面，基因激活過程中的關鍵是30nm染色質纖維的解聚和重塑，從而使各種轉錄因子接近DNA[44]。染色質重塑是指通過對染色質中核小體的定位動態改變染色質結構并以此調控基因表達的分子機制[45]。越來越多的證據表明，組成染色體重塑復合物的重塑因子功能變異，特別是氨基酸突變或缺失引起的變異與許多疾病的發生、發展密切相關。

表1 主要表觀遺傳修飾調控因子及其機制

Tab.1 Major epigenetic modification regulators and regulatory mechanisms

CategoryFactorMechanismReferenceHBVDNA methylationDNMT1,DNMT3A, DNMT3BDNAmethyltransferasecatalyzesthetransferofamethylgrouptothe5thcarbonatomofcytosinetoform5-methylcytosine(5mC),resultinginchangesinDNAconformation,stability,orDNAandpro-teininteractions,therebyregulatinggeneexpres-sion.(9、11-12)APOBEC,TET1,TET2, TET3,TDGTheconformationandstabilityofspecificgenessi-lencedbyDNAmethylationcanberestored,reacti-vatedandexpressedbyDNAdemethylaseaction.(14、16-17)Histone modificationsH3K4me,H3K36me3,H3K79me3,H3K9ac,H3K27ac,H3K122ac,H4R3me2aHistoneacetylationintroducesextranegativechargeinhistones,whichreducestheinteractionbetweenpositivelychargedhistonesandnegativelychargedDNA,makingDNArelaxationfortranscription.(18-19)H3K9me2,H3K9me3, H3K27me,H4R3me2sHistonemethylation,whilenotalteringtheelectri-calpropertiesofhistonesbyitself,recruitsmultipleproteinfactorstoinhibitoractivategeneexpres-sion.(18-19)Non-codingRNA interferencemiRNA-138,miRNA-224,miRNA-596,miRNA-101,miRNA-548ab,miRNA-3,miRNA-192-3p1,miRNAscaninteractwithepigeneticmodifiedenzymestoexertgeneexpressionregulation.2,miRNAsareregulatorsofepigeneticmodifica-tionsthatrecruitrelevantepigeneticfactorstomedi-atethemodificationofspecificsitesinthegenome(38-40、42-43)Chromation remodelingSUZ12,ZNF198,SWI/SNFGeneexpressionwasregulatedbyremodelingfac-torsthatalterthepositionandstructureoftightlystructured30nmchromatinfibers,knownasnu-cleosomes.(45-50)

染色質重塑與HBV在HepG2細胞中的病毒復制和轉錄相關[46]。研究者通過一個全基因組短發夾RNA(shRNA)文庫篩選出zeste12同源基因(果蠅)抑制因子(SUZ12)和鋅指基因mym-2(ZNF198)，它們可作為染色質重塑復合物的組成部分。通過siRNA敲低SUZ12和ZNF198后，發現HBV核心顆粒和mRNA水平均增加，且SUZ12/PRC2作為重要的染色質重構復合物組成部分，可通過H3K27me3修飾來抑制HBV的轉錄[47-48]，其調控HBV轉錄的詳細機制有待于進一步深入研究。SWI/SNF復合物(又稱BAF復合物)是目前研究比較深入的染色質重塑蛋白復合物，由10～15個蛋白質亞基組成[45]。作為影響染色質重塑的主要突變靶點，其亞基中有多個常見基因突變均可能會改變蛋白質的表達水平或蛋白質的結構[49-50]。在前述的PRMT5進展研究中，PRMT5除了可以使組蛋白H4R3和H3R8甲基化而參與HBV轉錄的表觀調控外，Brg1和hbrm作為SWI/SNF染色質重塑復合物的一部分，將PRMT5過表達時，Brg1與cccDNA的結合顯著增加；而PRMT5敲低時，Brg1與cccDNA的結合顯著降低。以上提示PRMT5介導HBV cccDNA轉錄的表觀遺傳機制之一與Brg1的SWI/SNF染色質重塑密切相關,但是hbrm與Brg1不同，hbrm與cccDNA的結合不隨PRMT5的改變而發生顯著改變[30]。

5 結語與展望

隨著基因調控的表觀遺傳學機制研究的不斷進展，人們對HBV cccDNA復制與轉錄的相關機制研究有了更深入的認識。就目前而言，CHB患者的抗病毒療法都無法達到清除患者體內的cccDNA或者至少完全滅活cccDNA的目標。表觀遺傳學的飛速發展，為我們提供了一種新角度、新思路和新方向。但是，基因表達調控的過程十分復雜，需要不斷地深入探索。期待在未來，能闡明HBV cccDNA特異性表觀遺傳的調控機制，早日開發能有效清除HBV cccDNA的新型治療藥物或方法，并最終達到治愈CHB的目標。