4株霍亂弧菌非產毒株溶源性噬菌體pre-CTXΦ的基因組結構分析

李旭，趙林，樊粉霞，李哲，盧昕，逄波，闞飆

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室， 北京 102206

分泌霍亂毒素(cholera toxin，CT)的霍亂弧菌產毒株可導致感染者發生劇烈的水樣腹瀉[1]，引起霍亂暴發和流行。霍亂弧菌包括一大類基因組明顯差異的菌群，目前已發現超過200個血清群。引起霍亂暴發和流行的霍亂弧菌主要有O1和O139兩個血清群。霍亂毒素由ctxAB基因編碼，該基因位于霍亂弧菌溶源性絲狀噬菌體CTXΦ上[2]。CTXΦ的gⅢ基因編碼產物PⅢ能夠與霍亂弧菌的毒素共調菌毛(toxin co-regulated pilus, TCP)中的主要亞單位TcpA發生相互作用，因此，CTXΦ能以TCP為受體感染霍亂弧菌，并以霍亂弧菌染色體上的dif序列為特異整合位點，將CTXΦ基因組整合到霍亂弧菌染色體中，導致ctxAB發生水平轉移，形成新的產毒霍亂弧菌[3]。

CTXΦ的基因組由重復序列2(repeat sequence 2，RS2)和核心區組成。RS2中含有與噬菌體復制和整合相關的rstA和rstB基因，另外還有抑制這2個基因表達的rstR基因。rstR編碼產生的RstR蛋白，能抑制CTXΦ超感染作用。核心區則由psh、cep、gⅢ、ace、zot和ctxAB基因組成，其結構相對保守[2, 4]。此外，在CTXΦ的基因組結構兩側，常見1個RS1結構。RS1由rstR、rstA、rstB和rstC組成，作為CTXΦ的輔助噬菌體，發揮促進CTXΦ的復制和整合作用[5]。rstA、rstB和rstC基因相對保守，而rstR基因的序列變異則非常明顯，因此rstR基因是區分和命名不同CTXΦ亞型的主要依據。O1血清群古典型菌株和El Tor型菌株的rstR序列分別稱為rstRclass和rstRET，兩者之間的序列差異很大，且相互之間沒有由rstR序列型介導的對相同CTXΦ超感染的免疫能力[6-7]。O139群菌株中的rstR大部分是rstRET[8], 后來，相繼發現了新的rstR序列型，如rstRcalc和rstR6[9-10]。除了攜帶ctxAB的CTXΦ外，在霍亂弧菌中還發現了不攜帶ctxAB的CTXΦ，命名為nct-CTXΦ[11]或pre-CTXΦ[12]。rstR也是pre-CTXΦ中變異最為明顯的基因[13-14]。除此之外，CTXΦ/pre-CTXΦ基因組在霍亂弧菌基因組中還具有多拷貝串聯的復雜形式，可整合至霍亂弧菌大、小染色體上[13-14]。

目前對O1群和O139群產毒霍亂弧菌中CTXΦ/pre-CTXΦ家族成員基因組的結構和分布研究較多，但自環境中分離的不攜帶ctxAB的O1、O139群霍亂弧菌非產毒株同樣具有豐富的pre-CTXΦ家族及其基因組排列的多樣化[6-7, 13, 15-16]。后者基因組多態性也非常明顯[17]，其是否攜帶pre-CTXΦ的多樣性也值得關注。

對于霍亂弧菌中CTXΦ和pre-CTXΦ基因組的分析，不但可豐富這類溶源性的絲狀噬菌體分類及對霍亂弧菌中CTXΦ和pre-CTXΦ家族成員多樣性的認識，也有助于研究產毒株的產生和新流行克隆群的形成。本研究中，我們篩選了4株攜帶pre-CTXΦ的O1和O139群霍亂弧菌，對其中的pre-CTXΦ進行了結構和整合位點的分析。結果發現了O139群霍亂弧菌非產毒株中的pre-CTXΦ基因組明顯的序列型和排列多樣化，顯示出霍亂弧菌中該噬菌體家族的復雜進化及對宿主感染和整合的復雜性。

1 材料與方法

1.1 菌株和染色體DNA提取

O139群霍亂弧菌菌株VC3741(序列號： SAMN11287978)、VC3193(序列號：SAMN11287980)、 VC702(序列號：SAMN11287979)和O1 群霍亂弧菌菌株VC1813(序列號：SAMN11287981)為本室保存。其中VC3741和VC3193分離于自然水體， VC702和VC1813分離于養殖牛蛙。4株霍亂弧菌均不攜帶霍亂毒素基因。菌株經LB培養基增菌培養，用Genomic Wizard試劑盒(Promega公司)按照說明書提取菌株DNA。

1.2 基因組框架圖測定

使用Hyper Prep Kit( Kapa Biosystems公司, kk8504)構建長度為350 bp插入片段的DNA測序文庫。采用Illumina公司的Illumina HiSeqX Ten測序，雙端讀長為150 bp。

1.3 基因組完成圖測定

構建片段長度>10 kb的測序文庫，使用PacBio RSII平臺進行完成圖測定。

1.4 pre-CTXΦ基因組序列的獲取

從GenBank中下載所有霍亂弧菌的基因組數據，篩選沒有ctxAB但含有pre-CTXΦ的非產毒株。具體流程如下：通過Trimmomatic-0.38對原始reads數據進行質量控制；使用SPAdes-3.11.1對質控后的reads數據重新進行組合；之后使用本地blast+比對查找ctxAB、tcpA和gⅢ序列；對于完成圖和只有組裝序列的基因組數據，直接使用本地blast+比對查找ctxAB、tcpA和gⅢ序列。如果某一個基因組中tcpA和gⅢ均為陽性，且ctxAB基因為陰性，則認為是攜帶pre-CTXΦ的基因組。共篩選到6株菌株的基因組符合條件，分別是TUC_VC849_07(O1群)、TUC_VC182_14(O1群)、TUC_Me3(非O1/非O139群)、2710(O1群)、2174(O1群)和2012EL-1759(非O1/非O139群)。

1.5 tcpA和gⅢ進化樹的構建及比較

使用muscle分別對tcpA和gⅢ的核苷酸和氨基酸序列進行多序列比對，使用RAxML構建進化樹；再通過R語言treespace包比較兩者之間的進化關系。

2 結果

2.1 基因組測序及與產毒流行株的進化關系

選擇4株具有pre-CTXΦ基因簇的非產毒株進行了基因組測序，包括O1血清群中的3株(VC3193、VC3741和VC702)和O139血清群中的1株(VC1813)。在菌株VC1813和VC3193第2代測序的組裝結果中，pre-CTXΦ位于完整的contig中(表1)。而在菌株VC702和菌株VC3741第2代測序的組裝結果中，pre-CTXΦ位于多個contig中，未得到完整的pre-CTXΦ結構。隨后我們利用PacBio RSⅡ系統，對VC702和VC3741的基因組進行了第3代測序(長讀長)，使用該測序結果進行基因組序列組裝，并使用第3代測序(短讀長)的結果進行校正，最終獲得這2株菌的基因組完成圖(表2)。

表1 菌株VC1813和VC3193基因組2代測序的組裝結果

表2 菌株VC702和VC3741經Illumina HiSeqX Ten和PacBio RSII系統測序并組裝的全基因組序列基本情況

Tab.2 Complete genomes of the strains VC702 and VC3741 sequenced and assembled by Illumina HiSeq X Ten and PacBio RSII

Strains(Serogroups)G+C%Chromosome1(bp)Chromosome2(bp)Plasmid(bp)Length(bp)AmountofplasmidVC702(O1)47.57314502310974653399842764861VC3741(O1)47.5230077951049053-40568480

為確定這些菌株與霍亂弧菌O1/O139群流行株及與其他血清群的遺傳學關系，我們選取了霍亂弧菌O1群(古典型和El Tor型)、O139群，以及非O1/非O139群共計44株基因組序列，其中O1群和O139群產毒株為1961年以來我國和其他國家流行的產毒株33株(圖1)。以O1群El Tor型霍亂弧菌產毒株N16961的基因組為參照，去除基因組中的重復片段區域以及重組片段區域,獲得核心基因組(core-genome)。核心基因組中單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNPs)共 18 500 個，利用這些SNPs并通過Neighbor Joining方法構建了這些菌株基因的系統發生樹(圖1)，顯示O1群El Tor型和O139群產毒株聚集形成了明顯的產毒菌株簇，其SNPs差異在80～280個；O1群古典型產毒株O395及其他群的非產毒株表現出明顯分化差異，其中O139群非產毒株VC1813和O1群非產毒株VC702、VC3193與O1群El Tor型產毒株SNPs差異數目達到 3 300～18 500 個。但菌株VC3741與O1群El Tor型產毒菌株簇聚集在一起，說明該菌株與該流行菌株簇的基因組高度相似。數據表明在O1群和O139群的非產毒菌株中，盡管具有廣泛的基因組多樣化，但個別菌株也具有與大流行菌株相似的基因組背景。

The serogroups are marked in the brackets in the strain names. Non-toxigenic strain VC3741 was included within the cluster of the toxigenic O1 El Tor strains, which was shown in the box of dotted line. Strain O395 and the strains in this box, except for VC3741, arectxAB+, the others are allctxAB-.

圖1 4株非產毒株與霍亂弧菌O1/O139群流行株及與其他血清群的基因組進化關系

Fig.1 The phylogenetic profile of the of the four V. cholerae strains compared with other toxigenic and non-toxigenic strains

2.2 4株非產毒菌株染色體上的pre-CTXΦ基因組結構

利用組裝的4株研究菌株基因組序列，進行pre-CTXΦ基因組識別，發現在VC3741、VC3193和VC1813大染色體上有pre-CTXΦ基因組，而在菌株VC702的大、小染色體上均有pre-CTXΦ基因組。鑒定各基因組的基因結構、拷貝數及側翼的菌株染色體基因，得到以上菌株4個pre-CTXΦ基因組結構(圖2)。

在菌株VC3741的基因組中，pre-CTXΦ整合在大染色體鄰近基因rtxA的dif1位點上，該位點是霍亂弧菌染色體I的DNA進行復制時雙拷貝二聚體最后解離的位點, 而CTXΦ基因組利用該位點整合到霍亂弧菌染色體。它含有1個完整pre-CTXΦ基因組及前后各1個RS1結構，該區域為“RS1-RS2-core region-RS1”形式。進一步比對其rstR序列，發現pre-CTXΦ3741的rstR及下游RS1均為rstRET型，而其上游的RS1為rstR1型(相同序列的GenBank序列號：JX969003)。

菌株VC3193的pre-CTXΦ整合在基因rtxA旁側的dif1位點上，含有2個pre-CTXΦ基因組拷貝，無RS1結構，此區域結構為(RS2-core region)×2形式，2個拷貝的rstR序列相同，為rstRclass。該種前體以往出現在產毒株中，這是首次在非產毒株基因組中發現的。

菌株VC1813中pre-CTXΦ整合在基因rtxA旁側的dif2位點上。該前噬菌體中的rstR均為rstR232(GenBank序列號：DQ288668)，前噬菌體為pre-CTX232Φ，也是重復的雙拷貝，為(RS2-core region)×2形式。

在菌株VC702的大染色體中，pre-CTXΦ整合在基因rtxA旁側的dif1位點上，有串聯的2個相同拷貝，rstR序列型為rstZJ(相同序列的GenBank序列號：HM590227)，因此前噬菌體為pre-CTXZJΦ。其下游還含有1個RS1，rstR為rstR-5型(相同序列的GenBank序列號： AF133308)，該區域結構為(RS2-core region)×2+RS1形式。在該菌的小染色體上，有RS1在VCA0569和VCA05702基因之間dif1位點上的整合，沒有pre-CTXΦ基因組。該區域實際有2個串聯的RS1，rstR序列型均為rstR-4**(相同序列的GenBank序列號：AF133307)。這種pre-CTXΦ及RS1(GenBank序列號：SRIL00000000)的染色體整合形式系首次報道。另外，在第2個RS1的rstA基因中插入一個轉座子結構，包含4個基因，分別編碼重組酶、甲硫氨酸抑制子樣蛋白、PIN 結構域核酶和Tn3家族轉座酶。經蛋白質庫比對，發現這些基因與來自肺炎克雷白菌(Klebsiellapneumoniae)DA48896的質粒p48896_2(GenBank序列號：CP024431.1)上4個編碼基因的序列一致性達99%。

圖2 4株非產毒株pre-CTXΦ及RS1基因組的染色體整合排列

Fig.2 Integrated genome arrangement of pre-CTXΦ and RS1 in the chromosomes of the strains used in this study

2.3 非產毒株pre-CTXΦ的受體識別蛋白PⅢ及所在菌株的感染受體TcpA序列的多樣性

CTXΦ中PⅢ的吸收結構域(D2，134～252位氨基酸)能與TcpA的結構和相關結構域(SD_ID，121～191位氨基酸)相互作用，從而介導CTXΦ整合到細菌的染色體上[18]。但TcpA和PⅢ在不同菌株中序列可有所不同。進一步分析4株菌株中TcpA及其pre-CTXΦ攜帶編碼的PⅢ的核苷酸和氨基酸序列。比較中還另外包括了9株霍亂弧菌：O1群El Tor型參考株N16961和O1群古典型參考株O395，非O1/非O139 群菌株TUC_Me3和2012EL-1759，O1群菌株TUC_VC182_14、TUC_VC849_07、2710、2174[19]及O139群菌株ICDC-VC661。相應菌株的基因序列從GenBank中獲取，要求這些菌株同時具有CTXΦ/pre-CTXΦ以及完整tcpA基因序列，并盡可能包括較多血清群。對這些菌株的tcpA核苷酸序列進行比對，進化樹顯示(圖3)本研究中的VC3741和VC3193與第7次大流行的El Tor型菌株N16961序列相同，VC1813也與已測序發現的兩個菌株序列相同，但VC702顯示了與所有菌株較大的差別，是一個新序列型。所有13株的TcpA氨基酸序列比較顯示，氨基酸序列差異主要出現在αβloop區以及D區[20]，在TcpA的結構和相互作用結構域(SD_ID)存在大量的變異位點(圖3)。在PⅢ的基因序列比對中(圖4)，發現菌株VC3741和VC1813的pre-CTXΦ分別為pre-CTXETΦ和pre-CTX232Φ，均與第7次大流行的O1群El Tor型菌株N16961中帶ctxAB毒素基因的CTXETΦ非常相似；菌株VC702的pre-CTXZJΦ中PⅢ的基因序列則比較獨特，為新的序列亞型；菌株VC3193中攜帶pre-CTXclassΦ，其PⅢ的基因序列更接近于O1群古典型菌株O395中攜帶的CTXclassΦ。氨基酸序列比較(圖4)顯示，氨基酸位點變異主要出現在D2區，該區是與TcpA相互作用的區域[18]。本研究中菌株VC3741、VC1813和VC702攜帶的3類pre-CTXΦ與El Tor型菌株N16961的基本相同，而VC3193與第6次大流行中的古典型菌株O395序列更為接近，但存在3個氨基酸殘基的差異，屬類古典型序列。

圖3 菌株tcpA基因序列進化樹及蛋白氨基酸序列比對

Fig.3 Phylogenetic analysis (up) of thetcpAgenes and their amino acid sequence alignment (down) from the strains used in this study

圖4 菌株CTXΦ/pre-CTXΦ的gⅢ基因序列進化樹及蛋白氨基酸序列比對

Fig.4 Phylogenetic analysis (up) of the CTXΦ/pre-CTXΦgⅢ genes and their amino acid sequence alignment (down) from the strains used in this study

3 討論

早先對霍亂弧菌大流行菌株攜帶CTXΦ的研究發現O1群El Tor型和O139群產毒株主要攜帶El Tor型的CTXΦ基因組。但目前在非產毒株中，發現了更多具有不同序列型的pre-CTXΦ以及基因組上復雜的整合排列方式。因此，CTXΦ/pre-CTXΦ實際上是一個具有多種序列型的復雜家族。本研究報道了pre-CTXΦ新的序列型以及在菌株染色體上的排列方式。

典型的CTXΦ基因組長約7.2 kb，pre-CTXΦ長約6 kb，另外RS1長度約2.7 kb，這些序列還具有多拷貝串聯的復雜形式。因此，應用第2代基因組測序難以組裝出結構復雜的CTXΦ/pre-CTXΦ在染色體上的基因組排列。使用PCR確定基因間相互位置關系并通過Sanger測序驗證構建其基因組物理圖譜，將會涉及復雜的設計分析過程，且需要對多種可能組合進行驗證和排除。本研究則采用第3代基因組測序方法，基于PacBio平臺的長讀長測序以及用短讀長測序對序列進行矯正和補充，得到了完整的pre-CTXΦ在菌株中整合位置和基因組排列信息，這顯示了基因組長讀長測序以及整合高序列準確性的短讀長測序分析長片段重復序列的優勢。

產毒O1群El Tor型霍亂弧菌可引起全球流行，這類流行菌株攜帶的CTXΦ中，只檢測到3種rstR序列型，而rstRET是占絕對優勢的型別，極少出現2種或以上rstR序列型的CTXΦ同時存在于1個菌株的情況[15, 19, 21]。多數O139群產毒株中CTXΦ的結構也類似于El Tor型產毒株，但本研究也發現一些菌株中有較為復雜的CTXΦ/pre-CTXΦ整合形式，有的菌株CTXΦ/pre-CTXΦ共存且具有不同的rstR序列型[22]。4株不攜帶ctxAB的O1和O139群霍亂弧菌中，檢測到5種rstR序列型別，3株具有串聯雙拷貝的pre-CTXΦ基因組，另2株具有復雜多樣的RS1整合形式。這些RS1還具有多樣的rstR序列型，與O1群El Tor型產毒流行株明顯不同。非產毒株與產毒株基因組存在明顯差異，從目前分析看，其攜帶的pre-CTXΦ也具有多樣的序列型，即rstR序列多樣；而產毒的O1和O139群流行菌株相對單一，主要為El Tor型CTXΦ，pre-CTXΦ很少見。在菌株VC3193中，存在古典型CTXΦ的前體pre-CTXclassΦ。霍亂弧菌中攜帶毒素基因ctxAB的CTXΦ有CTXclassΦ、CTXETΦ 和CTXcalcΦ，后兩者均被報道攜帶ctxAB的其前體形式，但CTXclassΦ的前體pre-CTXclassΦ以往一直未見報道。本研究發現的該基因組為第6次大流行的古典型菌株中CTXclassΦ的進化來源找到了前體。另外，菌株VC3741屬于O1群非產毒株，在其基因組系統發生樹上與O1群El Tor型產毒株聚集在一起，而其攜帶的pre-CTXΦ屬于El Tor型，這可能提示具有與大流行菌株相似基因組的非產毒株也傾向于獲得El Tor型的CTXΦ/pre-CTXΦ。

多種rstR序列型出現在1個菌株中，說明這些pre-CTXΦ和RS1具有相容性，即不同的rstR基因型產生的RstR蛋白不會對后來的噬菌體產生超感染的抑制，從而呈現了復雜的pre-CTXΦ/RS1基因組結構形式。有意思的是，在單個菌株小染色體上發現與肺炎克雷白菌質粒上序列一致的轉座成分也插入到其中1個RS1序列中，這說明O139群環境菌株在自然環境中也發生跨種屬的基因水平轉移。

通過PⅢ的D2區與TcpA中的SD_ID區相互識別和結合，是CTXΦ/pre-CTXΦ感染霍亂弧菌的第一步。且不論在CTXΦ/pre-CTXΦ的PⅢ，還是在霍亂弧菌菌株TcpA及其相互作用結構域，均發現了多種多樣的序列型。本研究中，我們通過對環境分離的O139群非產毒株基因組的分析，發現了還未曾報道的新的TcpA和PⅢ序列型，繼續豐富了霍亂弧菌中這類絲狀噬菌體及其受體的序列型。序列多樣性往往意味著對不同環境的適應性改變，可能是為適應生存壓力而形成的。而CTXΦ/pre-CTXΦ中PⅢ與TcpA相互作用的D2區也有序列多樣化的現象，是否這些具有相互識別和相互作用的區域序列高變化有可能的對應關系，即PⅢ序列改變，能與不同TcpA序列型有不同的親和力，還需要分析精細的蛋白結構域空間結構及其相互作用能力才能明確。

CTXΦ的感染和基因組整合是產生霍亂弧菌新產毒株的重要機制。目前發現CTXΦ/pre-CTXΦ家族具有復雜多樣的成員。對這些具有不同rstR序列型成員及其霍亂弧菌基因組整合的研究，可認識這類噬菌體基因組的多樣性和家族內基因組重組與進化等機制。更重要的是這些成員之間是否存在超感染的交叉免疫，尤其是當pre-CTXΦ先感染一個菌株時，其是否能抑制攜帶霍亂毒素基因的同型和其他rstR序列型的CTXΦ再感染，即可能成為產毒株。因此，pre-CTXΦ在菌株中的整合，能夠在霍亂弧菌新產毒株產生上發揮影響作用。另外，不同PⅢ序列型的CTXΦ/pre-CTXΦ對不同TcpA序列型菌株的感染力是否有差異？兩者間受體-配體的識別和相互作用特異性與能力決定了CTXΦ/pre-CTXΦ對不同遺傳背景菌株的感染力，這有待于進一步的蛋白相互作用強度與特異性的實驗來研究。

總之，本研究利用第3代基因組測序(長讀長)的優勢，獲得了4株O1和O139群霍亂弧菌非產毒株中具有多拷貝重復長片段的pre-CTXΦ基因組結構，得到了前噬菌體pre-CTXΦ基因組及RS1基因組的排列圖譜，發現了新的pre-CTXΦ基因組及與RS1的排列組合形式。另外，結合對菌株與噬菌體的TcpA/PⅢ序列分析，展示了不同基因組進化分支中霍亂弧菌中CTXΦ/pre-CTXΦ的感染及整合到宿主菌基因組的結構多樣化，為研究這種具有自私特征的溶源性噬菌體的生存及攜帶毒素基因的CTXΦ在有和無pre-CTXΦ溶源化的霍亂弧菌中的傳播能力提供了更多的論據。