構建表達Flag-GPI的重組乙型肝炎病毒載體

胡孔穎，谷陳建，吳敏樂，陶帥，劉楠楠，劉晶，謝幼華

1. 復旦大學上海醫學院基礎醫學院病原生物學系，教育部、衛健委、醫科院醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032； 2. 上海市浦東醫院，復旦大學附屬浦東醫院檢驗科，上海 201399

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是重要的人類病原體，能感染人的肝實質細胞，引起急性和慢性肝臟炎癥、肝纖維化、肝硬化和肝癌[1-6]。只有人類和少數靈長類動物的肝細胞對HBV具有易感性[7-8]。人肝細胞對HBV的易感性可歸于多種因素，包括肝細胞表面的受體以及肝細胞內的蛋白和其他因子。早期的研究顯示，肝細胞內富集的轉錄因子可調控HBV的基因表達。2012年肝細胞特異的牛磺膽酸鈉共轉運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)被鑒定為HBV的受體，極大地促進了對HBV易感性的研究[9-11]。在此基礎上構建的過表達人NTCP的人肝癌細胞系HepG2-NTCP能夠被HBV有效感染，為闡明HBV生活史提供了重要研究系統。但是在人肝癌細胞系Huh7細胞和未分化的HepaRG細胞中，過表達人NTCP后雖然可以造成HBV的感染，但是感染效率很低；在小鼠肝癌細胞系和大鼠肝癌細胞系如Hepa1-6、Hep56.1D和TC5123中，即使過表達人NTCP也不能使HBV有效感染[12-13]。并且，HBV感染HepG2-NTCP細胞系不僅要求有較高的感染復數(multiplicity of infection，MOI)，還需要聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的輔助[14]。因此，人肝細胞對HBV的易感性還需更深入的研究。

本課題組在前期研究中基于HBV臨床突變株6898構建了具有較高復制能力的HBV載體5c3c。5c3c在包膜大蛋白preS1區缺失384bp，用以插入外源的基因片段，插入的外源基因可以利用其上游的Sp1啟動子啟動表達。此缺失部位包括preS1的C端和preS2的N端，位于不同開放讀碼框架的Spacer區域(圖1B)[15-16]。此外，還將HBV包膜大蛋白preS1的起始密碼子ATG突變為ACG，以避免preS1殘留序列對下游插入的外源基因表達產生影響[15, 17]。本課題組前期在5c3c載體中插入了3種基因，分別是干擾素基因、shRNA的表達系統及ds-red基因，這些重組HBV載體不僅轉染Huh7細胞后能表達外源基因，且保留有較高的復制能力，在回補HBV包膜蛋白的情況下，能夠產生具有感染力的重組HBV(recombinant HBV，rHBV)[15]。

糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)是一種蛋白質，通過翻譯后修飾而在其C端獲得的一個脂質錨，被修飾的蛋白質可以通過GPI錨定在細胞膜上，暴露于細胞表面[18-21]。能夠獲得GPI修飾的蛋白N端和C端各含有一個信號肽，N端信號肽的作用是將蛋白質帶到內質網(endoplasmic reticulum，ER)內腔進行加工；C端信號肽又被稱為GPI添加信號肽，其作用是用來替換預先在ER內合成的GPI，使GPI通過特定的化學鍵連接在蛋白質的C端[22-24]。

基于HBV載體5c3c和GPI的特性，本研究設想在5c3c載體中插入外源基因，該基因編碼帶有N端分泌信號肽和C端GPI添加信號肽的Flag標簽，通過構建表達Flag-GPI的重組HBV，使Flag標簽表達在感染細胞的表面,從而可以利用Flag抗體對感染細胞進行篩選，進而為HBV易感性提供研究工具[25-31]。

在本研究中，設計了兩個將Flag序列插入5c3c中的方案。第1個方案中，在5c3c的插入位點依次插入自帶起始密碼子(ATG)的N端信號肽序列，Flag編序列以及GPI添加信號肽序列；第2個方案中，將5c3c 載體中preS1的ACG突變回ATG，稱為5c3cT載體，利用preS1的N端充當信號肽，在5c3cT中順序插入Flag和GPI添加信號肽序列。通過實驗驗證，最后得到重組HBV載體5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI。它們轉染Huh7細胞和HepG2-NTCP細胞后，可以將其表達的Flag錨定在細胞膜上。這兩種重組HBV載體都保持一定的病毒復制能力，復制子5c3cT-Flag-GPI在回補HBV包膜蛋白的情況下，可以包裝形成完整的重組HBV顆粒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系293FT細胞系、Huh7細胞系由本實驗室保存，HepG2-NTCP細胞系[帶有滅瘟素(blasticidin S)抗性基因和人NTCP基因，在含blasticidin S的培養條件下能穩定表達人NTCP的HepG2細胞系]由王勇翔副教授惠贈。

1.1.2 質粒5c3c由本課題組保存，pCDNA3.1質粒由吳可菲碩士惠贈，pRRL-cPPT-PGK-GPI-scFv-AB65-HIS質粒由周保羅課題組惠贈，巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-1.1-HBV(由CMV啟動子啟動的1.1拷貝的HBV基因組)由本課題組保存，p-LMS(可以表達HBV大、中、小3種包膜蛋白的質粒)由崔曉嫻博士惠贈。

1.1.3 儀器和試劑主要儀器包括PCR儀(北京東勝創新生物科技有限公司)、pH計(上海天達儀器有限公司)、二氧化碳細胞培養箱(Thermo公司)、EVOS倒置熒光顯微鏡(北京東勝創新生物科技有限公司)、Leica SP8 X激光共聚焦顯微鏡系統(德國Leica公司)、LSR Fortessa流式細胞儀(美國BD公司)。主要試劑包括PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司)、Go Taq qPCR Master Mix(Promega公司)、快速質粒小提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、轉染試劑TurboFect(Thermo Fisher Scientific公司)、PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche公司)、DIG Easy Hyb Granules(Roche公司)、DMEM(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、Trypsin-EDTA(Gibco公司)、流式細胞抗體APC anti-Flag(Biolegend公司)、免疫熒光抗體anti-Flag(Sigma公司)、抗-preS1抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.1.4 引物合成引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物合成

1.2 方法

1.2.1 細胞培養細胞均在37 ℃ CO2培養箱中用DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)培養，HepG2-NTCP細胞的培養需要在培養基中另加blasticidin S(5 μg/ml)。

1.2.2 免疫熒光細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗2次，每次5 min。加入含有1% Triton X-100的PBS破膜，室溫孵育10 min。用含5% BSA、0.1% Triton X-100的PBS孵育細胞，進行封閉。棄去封閉液，用新配制的合適濃度的一抗孵育液(anti-Flag抗體按照1∶500～1 000 稀釋)室溫孵育2 h或4 ℃過夜。棄去一抗，PBS洗5次，每次5 min。配制合適濃度的二抗孵育液(一般按照 1∶500～1 000 稀釋)，室溫孵育1 h。棄去二抗，PBS洗5次，每次5 min。加入DAPI稀釋液，室溫孵育2 min。棄去DAPI，PBS洗5次，每次5 min。最后封片，置于熒光顯微鏡下觀察。檢測細胞膜表面抗原時PBS中不加入Triton X-100，其他步驟相同。

1.2.3 流式細胞術(針對6孔板的貼壁細胞)棄去舊的培養基后用PBS輕輕清洗細胞2遍，加入400 μl胰酶稀釋液(100 μl胰蛋白酶和300 μl PBS)，37 ℃下消化5～10 min。加入800 μl DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)終止消化作用，重懸吹散后350 g離心5 min。用PBS重懸，對細胞進行計數后分裝到1.5 ml的EP管中，使每管約含(5～10)×105個細胞。加入5 μl封閉液，室溫封閉10 min。加入2 μl 0.2 μg/μl的APC anti-Flag抗體，冰上避光孵育20 min。用PBS洗2次，每次350 g離心5 min，收集細胞。用500 μl PBS重懸后上流式細胞儀分析。

1.2.4 Southern印跡法配制質量體積比為1%的瓊脂糖凝膠，上樣，70 V電泳約2 h。取出膠，用變性液變性1 h。完成后，用中和液中和1 h。結束后，將凝膠、裁剪好的尼龍膜、濾紙浸泡入20×SSC中。轉膜過夜后，將尼龍膜在2×SSC溶液中浸泡5 min，接著紫外交聯2 min。將尼龍膜放入圓柱形管中，加入5 ml的預雜交液， 42 ℃預雜交30 min。取出探針，100 ℃變性5 min，迅速冰浴3 min。將探針加入新的預雜交液中，配制形成雜交液。倒出預雜交液，換成雜交液， 42 ℃雜交6～8 h。高鹽溶液洗膜2次，每次5 min。低鹽溶液洗膜2次，每次15 min。接下來在雜交爐中的步驟溫度都為 25～50 ℃。Washing緩沖液潤洗1～5 min。Blocking 緩沖液封閉30 min。anti-DIG antibody溶液孵育30 min。Washing緩沖液洗2次，每次15 min。Detection緩沖液潤洗2～5 min。在尼龍膜上覆蓋CSPD工作液，室溫避光5 min。發光，30 min以上。

2 結果

2.1 Flag-GPI表達載體的構建

通過GPI錨將蛋白錨定在細胞膜上并暴露于細胞膜外側，需要目的蛋白(多肽)的N端和C端各含有一個信號肽。根據文獻，選取了2個N端信號肽序列，分別命名為Bip和CD59。Bip信號肽序列來源于分泌表達載體pSecTag2A-Bip，其上Bip的作用是將所表達的蛋白引導入ER的分泌途徑。CD59是補體調節蛋白CD59的N端信號肽，CD59本身通過GPI錨而被錨定在細胞膜表面[32]。C端的GPI添加信號肽的基因序列采用了周保羅課題組惠贈的載體質粒pRRL-cPPT-PGK-GPI-scFv-AB65-HIS上的GPI添加信號肽基因序列。每個N端信號肽都含有起始密碼子(ATG)，GPI添加信號肽的C端含有終止密碼子(TGA)。

在真核表達載體pCDNA3.1中，選擇在EcoRⅠ與BamHⅠ之間的酶切位點插入N端信號肽基因序列、Flag編碼序列和C端GPI添加信號肽基因序列。為增強插入基因的翻譯，在N端信號肽的起始密碼子(ATG)前插入了Kozak序列(圖1A)。同時，也構建了不含N端信號肽序列的對照質粒，即在pCDNA3.1載體中僅插入Flag編碼序列和C端GPI添加信號肽，在Flag前端帶有Kozak序列和起始密碼子ATG(圖1A)。以上這些質粒分別被命名為pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI，pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI和pCDNA3.1-Flag-GPI。

在含有1.1拷貝HBV基因組的5c3c載體質粒上進行了同樣的操作，構建了5c3c-Bip-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI(圖1C)。

5c3c載體上preS1仍保留其在N端的11個氨基酸的編碼序列。HBV包膜大蛋白preS1的N端在天然情況下可被豆蔻?；?，因此可能含有將其定向帶到ER的N端信號肽?；谠撏茢啵瑢?c3c載體中preS1的突變起始密碼子ACG變回ATG，新的載體命名為5c3cT。隨后將Flag編碼序列和GPI添加信號肽序列依次插入5c3cT載體中(圖1C)。該載體質粒被命名為5c3cT-Flag-GPI。

A: The sequences coding the N-signal peptide (Bip or CD59), Flag, and GPI-addition signal peptide (GPI) were inserted respectively into the vectors pCDNA3.1. B: The organization of the 5c3c vector. C: The sequences coding the N-signal peptide (Bip or CD59), Flag, and GPI-addition signal peptide (GPI) were inserted respectively into the vectors 5c3c and 5c3cT. The mutated preS1 start codon (ACG) in 5c3c was reverted to ATG in 5c3cT.

圖1 Flag-GPI表達載體構建示意圖

Fig.1 Schematic presentation of Flag-GPI constructs

2.2 Flag-GPI的細胞表面錨定驗證

免疫熒光實驗結果顯示，pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉染Huh7細胞(圖2A)和293FT細胞(圖2B)后，可將Flag標簽錨定在細胞表面。陰性對照pCDNA3.1-Flag-GPI在細胞內可表達Flag，但不能將Flag標簽錨定在細胞表面(圖2A和2B)。通過流式細胞術進一步證實pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉染Huh7細胞后，細胞表面Flag陽性的細胞數量顯著增加(圖2C)。

將5c3c-Bip-Flag-GPI、5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI轉染Huh7細胞后進行免疫熒光實驗，發現5c3c-CD59-Flag-GPI轉染的細胞表面可檢測到Flag標簽(圖3A)，而5c3c-Bip-Flag-GPI轉染Huh7細胞后不表達Flag(結果未展示)，5c3cT-Flag-GPI轉染的Huh7細胞表面也呈現Flag陽性(圖3A)。免疫熒光實驗結果也證明，轉染5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI的 HepG2-NTCP細胞表面也能檢測到Flag標簽(圖3B)。流式細胞檢測結果進一步表明，5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI轉染的Huh7細胞可以將Flag標簽錨定在細胞膜上(圖3C)。

2.3 表達Flag-GPI的重組HBV具有復制能力

用DNA印跡法(Southern印跡法)驗證獲得的兩個重組HBV復制子轉染Huh7細胞后能否有效復制。實驗結果表明，5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI均能復制(圖4)。如圖4所示，在復制能力上空載體5c3c的最強，5c3cT-Flag-GPI與CMV-1.1-HBV相當，5c3cT-Flag-GPI比5c3c-CD59-Flag-GPI強。

由于5c3cT-Flag-GPI的復制能力比5c3c-CD59-Flag-GPI強，因此采用5c3cT-Flag-GPI進行進一步的實驗。在Huh7細胞中共轉表達HBV表面蛋白的p-LMS質粒和5c3cT-Flag-GPI質粒，純化和濃縮細胞培養上清液后，用抗preS1的抗體進行pull-down實驗，判斷有無完整的重組HBV產生(圖5)。共轉p-LMS質粒和5c3c載體作為陽性對照，單轉5c3c載體作為陰性對照。實驗結果顯示，5c3cT-Flag-GPI在回補HBV包膜蛋白后，可產生完整的重組HBV顆粒。

A: Transfections of pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI and pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI into Huh7 cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. B: Transfections of pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI and pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI into 293FT cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. C: Flow cytometry analysis. Surface-displayed Flag positive cells were detected and selected by anti-Flag antibodies.

圖2 pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉染細胞后可以將Flag標簽錨定在細胞表面

Fig.2 Anchorage of Flag tags on the cell membrane after transfection of pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI and pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI

A: Transfections of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI into Huh7 cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. B: Transfections of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI into HepG2-NTCP cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. C: Flow cytometry analysis. Surface-displayed Flag positive cells were detected and selected by anti-Flag antibodies.

圖3 5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI轉染細胞后可以將Flag標簽錨定在細胞表面

Fig.3 Anchorage of Flag tags on the cell membrane after transfection of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI

From the left to the right, the samples are 5c3c, CMV-1.1-HBV, 5c3cT-Flag-GPI, 5c3c-CD59-Flag-GPI, and blank control. 5c3c and CMV-1.1-HBV served as positive controls. Blank control served as a negative control.

圖4 Southern印跡法驗證5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI的復制能力

Fig.4 The replication ability of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI verified by Southern blot

Cotransfection of 5c3c and p-LMS with pull-down assays served as positive control, transfection of 5c3c with pull-down assays served as negative control.

圖5 Pull-down實驗驗證重組HBV的產生

Fig.5 Verification of formation of recombinant HBV particles with pull-down assays

3 討論

在本研究中，首先在pCDNA3.1載體上獲得pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和 pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI，轉染Huh7和293FT細胞后可將Flag標簽錨定在細胞表面(圖2)。這兩個質粒轉染293FT細胞后，進行對細胞膜穿孔和未穿孔的免疫熒光實驗。結果顯示，被穿孔的293FT細胞，細胞膜上有明顯的穿孔痕跡，細胞膜表現為不連續的點狀綠色熒光。推測與蛋白質相連的GPI錨(兩個疏水的脂肪酸長鏈)大多插入在細胞膜上的脂質筏區域，該區域的穩定性較高，不溶于Triton X-100。因此在采用Triton X-100對細胞膜進行穿孔時，脂質筏區域不能被Triton X-100“穿透”，所以錨定有Flag而未被Triton X-100消化的脂質筏就呈現為不連續的點狀綠色熒光[33-34]。然而對比觀察pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉染Huh7細胞后被Triton X-100穿孔后的免疫熒光結果發現，Huh7的細胞膜偶爾會出現不連續的點狀綠色熒光，更多的是直接觀察到細胞內核周圍的綠色熒光，這與293FT細胞上所觀察到的結果并不完全一致。原因可能是293FT細胞和Huh7細胞的細胞膜磷脂雙分子中脂質筏的比例可能不一樣， 293FT細胞膜磷脂雙分子層中脂質筏的比例可能高于Huh7細胞膜中的，293FT細胞的細胞膜更難被Triton X-100消化，因此穿孔后293FT細胞的細胞膜更多呈現為不連續的點狀綠色熒光。

pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI 和 pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉染Huh7和293FT細胞后可以將Flag標簽錨定在細胞膜上說明Bip和CD59可以正常發揮信號肽的功能，并且與Flag C端的GPI添加信號肽協同作用，協助將Flag標簽錨定在細胞膜上。但是將這兩個N端信號肽對應插入在載體5c3c上，就只有5c3c-CD59-Flag-GPI轉染Huh7細胞后可以將Flag標簽錨定在細胞膜上，而5c3c-Bip-Flag-GPI不能在轉染的Huh7細胞中表達Flag標簽(結果未展示)。此現象說明即使在pCDNA3.1載體上可以正常發揮作用的N端信號肽在5c3c載體上也不一定具有活性?？赡苁且驗?c3c載體更為復雜，插入的N端信號肽在HBV基因組中發揮功能尚需具備一定的兼容性。本研究的目的之一是使Flag標簽在轉染細胞內可以通過GPI錨定在細胞膜上，但是否表達Flag標簽的細胞都能有效地將Flag進行GPI修飾進而錨定在細胞膜上還需要進一步的研究，后續實驗將檢測Flag 膜錨定細胞數占Flag陽性細胞數的百分比，從而衡量GPI修飾效率和(或)Flag-GPI細胞膜錨定的效率。

載體5c3cT-Flag-GPI轉染Huh7細胞后也可以將Flag標簽錨定在細胞膜上，證明5c3c中殘留的preS1序列確實具有N端信號肽的作用。HBV載體的相關研究也表明，HBV基因組的長度越短，該載體的復制能力則往往越強[16]。復制子5c3cT-Flag-GPI的基因組長度比復制子5c3c-CD59-Flag-GPI的短，但其復制能力比復制子5c3c-CD59-Flag-GPI的強，進一步驗證了這一觀點。

本研究基于課題組前期工作基礎和GPI錨的相關特性，構建了重組HBV載體5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI，轉染Huh7細胞后可將Flag標簽通過GPI錨定在細胞膜上，并可利用Flag抗體通過流式細胞術對表面含有Flag標簽的細胞進行分選。5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI轉染Huh7細胞后都能進行復制，證明其都能產生完整的病毒核心顆粒。在反式回補HBV的包膜蛋白之后，5c3cT-Flag-GPI可以產生完整的重組HBV。因為產生的重組HBV滴度較低，所以重組HBV未能有效感染HepG2-NTCP細胞(結果未展示)。由圖5可知在共轉5c3cT-Flag-GPI和p-LMS未進行pull-down的情況下，復制子5c3cT-Flag-GPI的復制能力很強，說明此時可以產生大量的HBV核心顆粒；但是在共轉5c3cT-Flag-GPI和p-LMS進行pull-down時，形成完整重組HBV顆粒的滴度卻很低。該現象提示包裝形成的重組HBV滴度不高的原因可能是重組HBV的包裝系統不夠高效。提示后續實驗將改進包膜蛋白的提供方式來對重組HBV的包裝體系進行優化，本課題組以往的包裝系統采用反式提供HBV的包膜蛋白，但是包裝效率不高?？紤]到HBV的特性，順式提供其包膜蛋白將是我們優化包裝體系的一個重要研究方向?？偟膩碚f，本研究為進一步優化Flag-GPI重組HBV包裝體系和感染實驗奠定了基礎。