糞腸球菌對(duì)利奈唑胺低水平耐藥機(jī)制的研究及同源性分析

陳喆 張青 錢定良 蘇海珍 李向陽

腸球菌為革蘭陽性球菌，廣泛分布于人和動(dòng)物消化道及女性生殖道內(nèi)，是重要的條件致病菌，多見于醫(yī)院感染。由于其固有耐藥和獲得性耐藥的雙重特性，以及各類抗生素廣泛應(yīng)用造成的高選擇性壓力，導(dǎo)致多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）腸球菌逐漸增多，甚至出現(xiàn)耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistantenterococci，VRE）。利奈唑胺是一種人工合成的吧惡唑烷酮類抗菌藥物，通過與細(xì)菌核糖體50S亞基結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄的初

始步驟起抑菌作用，對(duì)革蘭陽性菌，包括耐青霉素的肺炎鏈球菌、耐甲氧西林的葡萄球菌和耐萬古霉素的腸球菌均有良好的抗菌作用。隨著利奈唑胺在臨床上的使用，陸續(xù)出現(xiàn)了耐藥菌株的報(bào)道[1-3]，根據(jù)近年衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示臨床上最常分離的耐藥細(xì)菌為腸球菌。已知耐利奈唑胺腸球菌的耐藥機(jī)制包括23S rRNA基因V區(qū)以及編碼核糖體蛋白L3、L4的基因突變和由攜帶多重耐藥基因cfr介導(dǎo)耐藥，近年又發(fā)現(xiàn)新型耐藥基因optrA。本文對(duì)近年臨床分離的4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌的耐藥機(jī)制及其同源性進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集 2016年1月至 2017年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床分離非重復(fù)腸球菌感染標(biāo)本1 170份（糞腸球菌568株，屎腸球菌538株，其他腸球菌64株），全部菌株經(jīng)Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)配套的鑒定卡（GP）和藥物敏感試驗(yàn)卡（GP-68）行菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗(yàn)。分離出耐藥菌株4株（E01-E04），均為糞腸球菌，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）再次鑒定，并采用微量肉湯稀釋法確認(rèn)利奈唑胺最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC29212，cfr基因陽性對(duì)照菌株為本實(shí)驗(yàn)室頭狀葡萄球菌，體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)2017年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the clinical and laboratory standards institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判讀。利奈唑胺的判讀標(biāo)準(zhǔn)為：敏感（S）為 MIC≤2μg/ml，中介（I）為 MIC=4μg/ml，耐藥（R）為 MIC≥8μg/ml。4株菌株標(biāo)本類型分別為膿液、創(chuàng)面、尿液、腹水；分別來自普外科、燒傷修復(fù)科、泌尿外科和婦科。

1.2 主要試劑及儀器 Vetik 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、GP鑒定卡、GP-68藥敏鑒定卡、MALDITOF-MS質(zhì)譜儀（法國bioMerieux公司）；LB液體培養(yǎng)、哥倫比亞血瓊脂平板（英國Oxoid公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR擴(kuò)增試劑、DNA Marker（DL2000）（上海生工生物工程公司）；PCR擴(kuò)增儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；50*TAE緩沖液、瓊脂糖粉末、gold view核酸染料（上海賽百威基因技術(shù)有限公司）。

1.3 細(xì)菌基因組提取 將冷凍干燥保存的腸球菌復(fù)蘇并接種至哥倫比亞血瓊脂平板，35℃培養(yǎng)24h后，再將腸球菌接種LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行過夜增菌，12～16h后根據(jù)北京天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取糞腸球菌基因組DNA模板。

1.4 PCR擴(kuò)增 23S rRNA V區(qū)基因、核糖體蛋白L3和L4編碼基因（rplC、rplD）及多重耐藥基因cfr和optrA的引物由上海生工生物工程公司合成，具體引物序列見表1。PCR 體系為：DNA 模板 2μl，上、下游引物各 1μl，PCR Mix（2*）25μl，加滅菌雙蒸水至 50μl。

表1 PCR引物序列

取5μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)觀察，剩余陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司雙向測(cè)序拼接，測(cè)序合格的結(jié)果通過NCBI GeneBank（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）與野生菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定糞腸球菌23S rRNA V區(qū)基因、L3和L4編碼基因是否存在突變位點(diǎn)及是否存在cfr和optrA耐藥基因。

1.5 多位點(diǎn)序列分型MLST 糞腸球菌MLST的7個(gè)管家基因（gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiql）引物序列和擴(kuò)增條件參照糞腸球菌數(shù)據(jù)庫（http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp）設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成引物。反應(yīng)體系同前。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后送上海生工生物工程公司測(cè)序，使用BioEdit軟件（Version7.0.9.1）處理測(cè)序結(jié)果，最后將測(cè)序結(jié)果錄入PubMLST比對(duì)，從而確定其ST型。將本研究獲得的等位基因序列數(shù)據(jù)使用eBURST軟件（Version 3，http://eburst.mlst.net/）進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果 4株糞腸球菌均表現(xiàn)為MDR，即對(duì)超過3種或3種以上抗菌藥物耐藥，對(duì)呋喃妥因、萬古霉素及替加環(huán)素均敏感，而對(duì)四環(huán)素、喹奴普汀/達(dá)福普汀、利奈唑胺均耐藥。微量肉湯稀釋法檢測(cè)法顯示4株對(duì)利奈唑胺的MIC均為8μg/ml，呈低水平耐藥。

2.2 突變位點(diǎn)及多重耐藥基因cfr和optrA的PCR測(cè)序結(jié)果 4株糞腸球菌的23S rRNA V區(qū)基因、核糖體蛋白L3和L4編碼基因均未發(fā)現(xiàn)任何位點(diǎn)突變（比對(duì)野生菌株GenBank CP033787），均未擴(kuò)增出cfr基因，但optrA基因均擴(kuò)增出陽性產(chǎn)物，且條帶大小與目的基因相符，經(jīng)測(cè)序比對(duì)4株均攜帶optrA基因，見圖1。本研究進(jìn)一步擴(kuò)增同期分離且對(duì)利奈唑胺敏感的10株糞腸球菌和標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 29212）是否攜帶多重耐藥基因cfr和optrA。結(jié)果顯示，10株臨床分離的利奈唑胺敏感糞腸球菌和標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC29212）均未攜帶cfr和optrA基因。

圖1 4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌optrA基因電泳圖（Marker：DL2000 Marker；N：陰性對(duì)照；E01-E04：4 株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌）

2.3 MLST分析 4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌屬于 4個(gè) ST 型，分別為 ST476、ST16、ST116、ST75。4株菌株再與MLST數(shù)據(jù)庫中972株糞腸球菌比較，發(fā)現(xiàn)第二大克隆群是ST16克隆復(fù)合體。本實(shí)驗(yàn)1株ST16、1株ST116和1株ST75屬于3個(gè)不同的ST克隆群，而1株ST476為單獨(dú)的ST型，見圖2。

圖2 MLST數(shù)據(jù)庫中972株糞腸球菌的種群快照?qǐng)D

3 討論

本研究共分離鑒定出腸球菌1 170株，其中利奈唑胺耐藥腸球菌4株，均為糞腸球菌。糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥率分別為0.7%和0.0%，稍低于衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的監(jiān)測(cè)報(bào)告（糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥率為1.2%和0.2%）。

腸球菌對(duì)利奈唑胺的主要耐藥機(jī)制可以分為兩大類：非轉(zhuǎn)移性耐藥（23S rRNA V區(qū)突變和核糖體蛋白L3、L4突變）和轉(zhuǎn)移性耐藥（多重耐藥基因cfr和新型耐藥基因optrA）。利奈唑胺是通過結(jié)合核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）的 A 位點(diǎn)發(fā)揮作用。A位點(diǎn)位于核糖體催化功能核心23S rRNA的V區(qū)，由此23S rRNA V區(qū)突變是目前已知最主要的耐藥機(jī)制，最常見的突變位點(diǎn)為G2576T[6]。核糖體蛋白L3大部分位于核糖體50S亞基的表面，有一個(gè)環(huán)狀的尾部延伸至肽基轉(zhuǎn)運(yùn)中心（PTC），L3的點(diǎn)突變（如F147L和A157R）可導(dǎo)致利奈唑胺MIC值的上升。核糖體蛋白L4也位于與PTC距離很近的區(qū)域。cfr基因編碼一種甲基轉(zhuǎn)移酶，這種酶能夠修飾細(xì)菌23S rRNA（在A2503的位置，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后的甲基化）并且導(dǎo)致對(duì)多種抗菌藥物（如利膽醇、林肯酰胺、吧惡唑烷酮類、鏈酶殺陽菌素A）產(chǎn)生耐藥。cfr基因大多以質(zhì)粒作為載體，2004—2012年的全球多中心監(jiān)測(cè)研究 ZAAPS顯示該耐藥機(jī)制在利奈唑胺耐藥腸球菌中很少見[8]，多見于利奈唑胺耐藥葡萄球菌。本研究對(duì)上述耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步研究，均未檢測(cè)到23S rRNA V區(qū)、核糖體蛋白L3和L4編碼基因任何位點(diǎn)突變，cfr基因也顯示為陰性，因此初步推斷4株利奈唑胺低水平耐藥與新發(fā)現(xiàn)的optrA基因有關(guān)。

optrA基因于2015年由Wang等[7]首次在中國動(dòng)物源和人源分離的腸球菌中發(fā)現(xiàn)，該基因既可以存在于染色體上，也可存在于質(zhì)粒上，是繼cfr之后報(bào)道的第2個(gè)可轉(zhuǎn)移性耐藥基因。其編碼一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于ABC家族，該家族是細(xì)菌中存在的一種外排裝置，可介導(dǎo)腸球菌對(duì)吧惡唑烷酮類和利膽醇類抗生素的耐藥性，還可以介導(dǎo)金黃色葡萄球菌對(duì)氯霉素類的耐藥性[7]。有研究顯示76.5%optrA基因陽性菌株對(duì)利奈唑胺非敏感，MIC為4～8μg/ml，大多數(shù)optrA基因陽性菌的cfr基因檢測(cè)結(jié)果為陰性[9-11]。本文顯示4株利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌均攜帶optrA基因，MIC為8μg/ml，且cfr基因陰性，與研究相符。在中國的21個(gè)省市29家醫(yī)院監(jiān)測(cè)到2004—2014年optrA基因陽性的腸球菌已經(jīng)從0.4%上升到3.9%，且在糞腸球菌中比屎腸球菌中常見（3.7%vs0.5%）[12]。本研究的4株optrA陽性利奈唑胺耐藥糞腸球菌為浙江瑞安地區(qū)首次報(bào)道。除外中國，在美國、意大利也發(fā)現(xiàn)了攜帶optrA基因的腸球菌[13-14]。

根據(jù)MLST分型結(jié)果和菌株分離科室等相關(guān)信息，推測(cè)利奈唑胺耐藥糞腸球菌菌株在本院呈散發(fā)，本院發(fā)現(xiàn)的 4 個(gè) ST 型，分別為 ST476、ST16、ST116、ST75，其中ST16型和ST476型亦有報(bào)道見于浙江、廣東和河南的醫(yī)院[10]。

綜上所述，本研究初步推斷攜帶optrA基因與糞腸球菌對(duì)利奈唑胺呈現(xiàn)低水平耐藥有關(guān)，可進(jìn)一步研究optrA基因的定位和遺傳背景，該基因的出現(xiàn)已經(jīng)引起了國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的關(guān)注，因此應(yīng)做好利奈唑胺耐藥菌的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，防止該類菌在醫(yī)院環(huán)境中的播散和流行。