兔膝骨關節炎模型的建立及評價*

歐慧瑜 李瑞鵬 邵珍怡 郭秋平

(廣州醫藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州 510240)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是由機械和生物因素引起的以關節軟骨退行性病變和滑膜炎性病變為主要特征的慢性疾病[1-2]，導致患者出現疼痛和功能障礙，嚴重影響其生活質量。建立一種能模擬OA發病過程的模型，對于篩選和評價治療OA的藥物非常重要。關節軟骨的直接損傷可以引起骨關節炎病變或軟骨再生，這主要取決于損傷的部位，損傷的大小和動物的年齡[3]。本研究中使用6月齡新西蘭兔，通過關節軟骨鉆孔致軟骨缺損成功制備了兔OA模型。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠意藥業股份有限公司)；6%戊巴比妥鈉；白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗動物

新西蘭兔(雌雄各半，6月齡)，由山東濟南金豐實驗動物有限公司提供(許可證號SCXK(魯)2014-0006)。動物飼養于普通級動物房，溫度16～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h照明/12 h黑暗交替，動物自由攝食和飲水。本實驗遵守廣東省實驗動物保護和使用指南，并經藥物非臨床評價研究中心的實驗動物倫理委員會批準。

1.3 儀器與設備

電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；3-18k高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；Elx800酶標儀(美國Bio Tek公司)；病理切片機(德國Leica公司)，OLYMPUS BX41 顯微鏡和DP71+IPP6.0圖像采集系統。

1.4 實驗方法

1.4.1動物分組:將檢疫合格的動物，根據體質量和性別隨機分成3組：假手術組，模型組和陽性對照藥氨基葡萄糖(劑量為0.034 g/kg)組，每組12只，雌雄各半。每天觀察各組動物的食量、大小便、精神狀態等。

1.4.2造模方法:取36只新西蘭兔，用6%戊巴比妥鈉(0.7 mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉動物。左側膝部內側縱向切口，長約2 cm，將髕骨翻向外側，顯露髕骨關節面。檢查膝關節腔有無積液或粘連，關節軟骨平坦，色澤正常后，先用直徑2 mm鉆頭在膝關節屈曲90°時髕骨所對應股骨內、外側髁間關節面中部初步定位，鉆出小凹陷，然后換4.2 mm的鉆頭在此基礎上鉆出直徑4.2 mm、深3 mm的關節軟骨缺損區。將髕骨復位，逐層縫合關節囊和皮膚切口。術后立即肌肉注射青霉素鈉以防止感染。假手術組的動物僅暴露髕骨不鉆孔，其余操作方法與上述描述相同。造模4周后，各組動物開始灌胃給藥，每天1次，連續給藥4周。各組動物的給藥體積均為10 mL/kg。假手術組和模型組給予相同體積的CMC-Na溶液。

1.5 檢測指標

1.5.1血清和關節液中IL-1β和TNF-α檢測:末次給藥后，動物靜脈采血，靜置2 h后，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。用注射器抽取1 mL生理鹽水注入關節腔沖洗，抽出沖洗液，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于-20 ℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說明書，檢測血清和關節液IL-1β和TNF-α水平。

1.5.2組織病理學觀察:采血結束后，處死動物，將各組動物造模側的關節軟骨和滑膜組織用4%甲醛溶液固定，脫水，包埋，切片后進行HE染色。參照Mankin’s評分標準對關節軟骨進行評分[4]，驗證OA模型是否復制成功。

1.6 統計方法

結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。用單因素方差分析(ANOVA)進行總體比較，發現差異再用Dunnett法進行多個劑量組與陰性對照組間的兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清、關節液中IL-1β和TNF-α水平

造模8周后，模型組動物血清、關節液中IL-1β、TNF-α水平明顯高于假手術組(P<0.05)；而連續4周給予氨基葡萄糖后，動物血清、關節液中IL-1β、TNF-α水平明顯下降(P<0.05)，結果見表1。

表1 動物血清、關節液中IL-1β和TNF-α水平Table 1 L-1βbeta and TNF-α in the serum and joint

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note: compared with model,#P<0.05; compared with sham,*P<0.05

2.2 關節軟骨HE染色

造模8周后，假手術組動物關節軟骨及周圍組織正常，關節面完整，無炎細胞浸潤；模型組動物軟骨表面不連續，交界處有裂隙，兩端整合不良，潮線模糊不清；氨基葡萄糖組動物損傷部位以纖維組織增生為主，內有多量軟骨細胞，軟骨表面連續，交界處無裂隙，兩端整合良好，結果見圖1。

圖1 兔膝關節軟骨病理圖(HE染色)Fig.1 Pathology of articular cartilage of Rabbit Knee Joint

2.3 關節軟骨Mankin’s評分

造模8周后，模型組動物軟骨組織評分為7.3分，與假手術組相比明顯升高(P<0.05)。連續4周給予氨基葡萄糖后，動物軟骨組織評分為5.1分，與模型組相比明顯降低(P<0.05)，結果見表2。

2.4 滑膜組織HE染色

造模8周后，假手術組動物滑膜襯層細胞未見增生、肥大、炎細胞浸潤；模型組動物滑膜襯層細胞增生、肥大，全層均有顯著炎細胞浸潤；氨基葡萄糖組動物滑膜襯層細胞增生、肥大，伴有少量炎細胞浸潤。結果見圖2。

表2 關節軟骨Mankin’s評分Table 2 Mankin’s score of articular

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note: compared with model,#P<0.05; compared with sham,*P<0.05

圖2 兔膝關節滑膜組織病理圖(HE染色)Fig.2 Synovial Histopathology of Rabbit Knee Joint

3 討論

骨關節炎(OA)是慢性、退變性的關節疾病，多發于中老年人群，導致患者的生活能力喪失甚至殘疾。隨著社會人口老齡化，每年的OA患者人數都在增加，給社會造成了沉重的經濟負擔[5]。目前臨床上常用的藥物如鹽酸氨基葡萄糖、非甾體類抗炎藥，僅能緩解癥狀，而且長期服用還會出現胃腸道不適等不良反應[6]。因此，迫切需要研究OA的發病機制，開發新的治療藥物。

理想的OA動物模型應該有大小、結構、軟骨損傷、疾病進程等都與人類相似的關節，采用相同的誘導方法可成功復制模型，而且動物的年齡能模擬OA患者[7]。目前常用的OA模型制備方法有手術法和非手術法，非手術法有化學法、自發性、轉基因模型等[8]。近年采用較多的方法是手術法，如Hulth模型[9]、改良的前交叉韌帶切斷模型[10]等，通過手術可迅速造成關節不穩而誘導OA，損傷嚴重，不能模擬OA慢性疾病的發病進程，不利于表現藥物的干預作用?；瘜W法是在關節腔內注射木瓜蛋白酶、膠原酶等[11-12]，但是造模程度難以確定。自發性OA模型動物更接近OA的發病進程，但是耗費時間較長，成本較高[13]。轉基因模型通過編輯基因獲得基因缺陷的動物，可用于研究特定基因在OA發病中的作用，但成本較高。

OA最初是以關節軟骨損傷為主，研究表明狗關節軟骨缺陷(1.5 mm直徑，0.5 mm深度)3周后可形成溫和的OA病變[14]。這種模型接近OA發病過程，損傷較輕，造模程度可以控制，也可用于其他種屬動物，如嚙齒類動物，兔，馬等[3]。本研究采用兔關節軟骨鉆孔造成軟骨缺陷(4.2 mm直徑，3 mm深度)，造模8周后，模型組出現軟骨結構改變，缺損和滑膜炎細胞浸潤等OA的特征，而且陽性藥物可以改善模型的這些癥狀。因此，該模型可為治療OA藥物的評價提供參考。