精神依賴藥物成癮模型建立及小腦Bax基因的表達*

謝明仁 俞發榮

(甘肅政法大學 甘肅省證據科學技術研究與應用重點實驗室， 蘭州 730070)

精神依賴物質(海洛因)的濫用與造成機體所有系統器官的毒性損傷作用有關。從偶爾的喜好活動過渡到長期的濫用和成癮，大多數成癮者的復發，即使經過長時間的禁欲，幾乎沒有有效和確定的治療機會[1]。精神依賴藥物成癮不但危害成癮者自身的身心健康,還會造成嚴重的社會問題[2]。有關海洛因成癮對大腦組織的損傷作用方面研究較多[3]，小腦與大腦、腦干和脊髓之間豐富的傳入和傳出聯系，參與軀體平衡和肌肉張力(肌緊張)的調節，以及隨意運動的協調。小腦損傷，機體的肌肉張力就會減退，隨意運動的協調性出現紊亂。因此，為了探索小腦在精神依賴藥物(海洛因)成癮和戒斷中的作用，建立精神依賴藥物成癮動物模型，為進一步研究精神依賴藥物成癮機制，為戒毒制定新的、有效的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：SPF級Wistar大鼠，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提供,實驗動物生產許可證號[SCXK (甘)2015—0001],實驗在甘肅政法學院SPF級實驗室進行，實驗動物使用許可證號[SYXK (甘)2015—0006]。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》規定，按3R原則給予實驗動物以人道關懷(倫理委員會審批號碼:GZF—2018—003)。

海洛因：為白色粉末, 純度為86.8%,由蘭州市公安廳禁毒辦提供，實驗時用滅菌蒸餾水配成所需要的濃度。鹽酸納洛酮，北京四環醫藥科技股份有限公司生產,批號:1806152；大鼠凋亡因子Bax試劑盒、大鼠Caspase-9試劑盒、大鼠Caspase-3試劑盒，購于上海紀寧實業有限公司；MK3-酶標儀,上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1動物處理：取SPF級Wistar大鼠20只(雄性)，體質量185～190 g。全部動物在SPF級實驗室IVC飼育盒飼養，自由飲食進水，明暗周期12 h，單籠飼養。動物房溫度22～24 ℃，濕度55%～65%，適應7 d。動物隨機分為2組,每組10只。對照組：肌肉注射生理鹽水10 mL/kg，每天2次；海洛因組：給予海洛因、納洛酮的方法、劑量以及持續時間均按文獻[4]操作。第15天腹腔注射鹽酸納洛酮(納洛酮是嗎啡樣物質受體特異拮抗劑，能迅速翻轉嗎啡作用，采用該藥的目的為觀察是否出現戒斷癥狀，判斷成癮模型建成與否)，待觀察完戒斷癥狀后取樣。

1.2.2取樣：實驗第15天，動物經乙醚吸入無痛麻醉，打開胸腔，從左心室推注生理鹽水100 mL，沖去血液，用4%多聚甲醛-1.25%戊二醛磷酸緩沖液(pH7.4)灌注固定，剝取大鼠小腦皮層組織5 mg，研磨成勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清用,以標準物的濃度為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，在540 nm波長下，繪出標準曲線和標準曲線的直線回歸方程。分別將大鼠小腦組織A值代入直線回歸方程，計算出樣品的濃度。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 成癮大鼠戒斷癥狀

按Maldonad法評分，給予鹽酸納洛酮1 h后, 大鼠出現扭體、濕狗樣抖、咬牙,跳躍、站立、上瞼下垂、清理毛發等戒斷癥狀,成癮動物模型建立成功，表1。

表1 海洛因成癮戒斷癥狀及評分標準Table 1 Heroin addiction withdrawal scoring criteria

注：與對照組比：**P<0.01

Note：compared with the control group：**P<0.01

2.2 海洛因對大鼠小腦組織Bax水平的影響

Bax標準曲線的直線回歸方程為：Y=6.3×10-3x+1.4×10-2，R2=0.9979。將大鼠小腦組織吸光度(A)代入方程，成癮大鼠小腦組織Bax水平比對照組升高了88.21%，圖1。

圖1 海洛因對大鼠小腦組織Bax水平的影響注：與對照組比：**P<0.01Fig.1 Effect of heroin on Bax level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group **P<0.01

2.3 海洛因對大鼠小腦組織Caspase-9水平的影響

Caspase-9標準曲線的直線回歸方程為：Y=1.4×10-3x+4.43×10-2，R2=0.998。將大鼠小腦組織吸光度(A)代入方程，成癮大鼠小腦組織Caspase-9水平比對照組升高了87.24%，圖2。

圖2 海洛因對大鼠小腦組織Caspase-9水平的影響注：與對照組比：**P<0.01Fig.2 Effect of heroin on Caspase-9 level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group： **P<0.01

2.4 海洛因對大鼠小腦組織Caspase-3水平的影響

Caspase-3標準曲線的直線回歸方程為：Y=5.0×10-4x+5.2×10-3，R2=0.999。將大鼠小腦組織吸光度(A)代入方程，成癮大鼠小腦組織Caspase-3水平比對照組升高了94.21%，圖3。

圖3 海洛因對大鼠小腦組織Caspase-3水平的影響注：與對照組比：**P<0.01Fig.3 Effect of heroin on Caspase-3 level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group： **P<0.01

3 討論

海洛因成癮者抑制控制功能受損是一種持久性的、不可逆的腦損傷[5], 海洛因成癮致使大腦皮質下中樞灰質體積減少[6]。功能性磁共振成像(fMRI)研究證明，長期吸食海洛因的成癮者大腦突顯性網絡功能連接異常增強[7]，從而引起腦默認網絡結構連接和功能連接不同程度破壞[8]以及頜下腺神經內分泌功能異常[9]。Bax基因是一種促進細胞凋亡的基因。人類Bax基因定位于染色體19q13.3～19q13.4，含6個外顯子，其C端含有疏水氨基酸組成的跨膜結構域，Bax蛋白為整合膜蛋白[10]。細胞線粒體內外膜之間的通透性轉換孔(PTP)具有調節線粒體通透性的作用。正常情況下,PTP是關閉的。在凋亡誘導因素 Bax 作用下，線粒體跨膜電位降低，PTP開放,導致線粒體膜通透性增大,使細胞凋亡的啟動因子如：細胞色素C,凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡誘導因子(AIF)等從線粒體內釋放出來。細胞色素C(Cytc)作為呼吸鏈中重要的電子傳遞體[11]，它從線粒體內膜上的釋放阻斷了電子向下游的傳遞，危及呼吸鏈的功能并導致超氧陰離子的加速產生，細胞色素C和Apaf相互作用可激活caspase-9,進而激活caspase-3,導致細胞凋亡。給予海洛因后，免疫組化實驗結果發現，大鼠小腦皮質細胞中Bax陽性細胞數明顯增多[4]，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測發現，大鼠小腦皮質細胞中Bax表達水平顯著升高，caspase-9和caspase-3活性顯著增強,與對照組比有顯著性差異(P<0.01)，與前期實驗結果相一致。免疫組化法和ELISA法檢測結果相互驗證實驗結果。實驗結果提示，海洛因成癮不但與大腦神經中樞有關，而且小腦皮質也參與海洛因成癮和戒斷過程。海洛因可能通過誘導小腦皮質Bax基因表達，激活caspase-9和caspase-3,引起小腦皮質細胞凋亡，導致小腦皮質細胞的損傷。本文的實驗結果為進一步研究精神依賴藥物成癮機制和戒毒治療提供新的參考依據。