姜黃素對過度訓練所致大鼠心肌細胞凋亡的保護作用

郭愛民,李亞俊,曹 卉,周海濤,曹建民,胡 戈,牛衍龍,任 奕

(1.中國石油大學(北京),北京 102249;2.中南大學,湖南長沙 410083;3.北京體育大學,北京 100084;4.北京聯合大學,北京 100023;5.北京聯合大學,生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191;6.贛南醫學院,江西贛州 341000)

科學、合理的運動訓練可以有效促進心臟形態結構可調節性和生理性重塑,改善心臟功能,提高生活質量和健康水平[1]。競技體育中常以長時程、高強度訓練刺激機體以提高運動員運動能力和競技水平,受運動負荷、訓練周期、恢復時間等多重因素影響,運動員常出現過度訓練綜合癥并誘發多器官出現病理改變和功能紊亂[2]。長時程、高強度運動時,各器官血流量發生急劇變化,尤其是心臟,需氧量顯著增加,氧自由基的產生隨之增加,抗氧化能力減弱[3-4]。在低濃度時,氧自由基在細胞內信號傳導和調節過程中起著“氧化還原信使”的作用[5],但過量氧自由基會加劇氧化應激反應,引起蛋白質和脂質過氧化以及DNA損傷,誘發凋亡信號,導致心肌細胞出現不可逆轉的損傷和死亡[6],與心臟功能紊亂、心血管疾病的發生密切相關[7]。由此可見,長時程、高強度運動引發的氧化應激增強,是誘發運動性心肌損傷的主要原因。

細胞凋亡在過度訓練引發的運動性心肌損傷中發揮了重要的作用[8]。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是細胞氧化應激反應中的關鍵轉錄因子,受kelch樣ECH相關蛋白1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)調控。Nrf2通過識別靶基因啟動子中的抗氧化反應元件ARE(antioxidant response element,ARE),調節下游眾多抗氧化酶的基因表達,發揮抗氧化作用,從而抵抗氧化應激。Nrf2也可與B淋巴細胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein,Bcl-2)抗氧化反應元件結合,通過上調Bcl-2表達,下調Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)表達,阻止細胞凋亡[9]。姜黃素是從姜科、天南星科中的部分植物根莖中提取的一種天然色素,作為世界衛生組織批準的天然食品添加劑及我國最早批準使用的天然色素之一,被廣泛應用于食品工業[10]。姜黃素作為一種多酚類化合物,具有抗氧化、抑炎及抑制腫瘤生長等藥理作用,其在醫學界的應用已得到越來越多的重視,在抗癌、抗炎、預防老年癡呆等多個領域發揮了重要作用。姜黃素可以直接使Nrf2上絲/蘇氨酸殘基發生磷酸化,促進Nrf2核易位[11],促進Nrf2與ARE的結合,誘導血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表達增加[12],抑制氧化應激反應。Keap1蛋白上的三個反應性半胱氨酸殘基Cys-151、Cys-273和Cys-288,能夠與親電子化合物共價結合[13],姜黃素中的酚羰基可以與半胱氨酸殘基上的巰基發生加成反應,促使Nrf2-Keap1解偶聯,從而促進Nrf2的核轉位[14]。姜黃素作為一種抗氧化劑,具有酚羥基和β-二酮2個活性部位,均可以提供質子,直接參與阻斷自由基的反應[15]。本團隊前期研究表明姜黃素對過度訓練引發的大鼠腎臟組織結構和功能損傷均具有保護作用,其機制與減輕凋亡、抑制炎癥有關[16-17]。

本實驗結合前期研究,通過觀察心肌組織病理學的改變,檢測心肌損傷標志物,結合心肌組織氧化應激指標以及細胞凋亡水平變化,來探討姜黃素是否可以通過延緩過度訓練所致氧化應激,有效抑制大鼠心肌細胞凋亡的發生,進而發揮對心臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素 純度>99%,陜西源泰生物科技公司;羧甲基纖維素鈉 純度>99%,上海士鋒生物科技有限公司;睪酮(testosterone,T)、皮質酮(corticosterone,Cor)放射免疫試劑盒 武漢Servicebio試劑公司;心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、心肌總抗氧化能力(Total antioxidative capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)酶聯免疫試劑盒 美國BD公司;TUNEL心肌細胞凋亡測試試劑盒 瑞士Roche公司;Nrf2、HO-1、Bax和Bcl-2的一抗、二抗和DAB顯色劑 武漢Servicebio試劑公司;SPF級雄性Wistar大鼠63只 體重(218.4±10.7) g 49 d齡,北京大學醫學部實驗動物科學部(動物生產合格證編號SCXK(京)2016-0010);基礎飼料 北京大學醫學部實驗動物科學部提供。

Allegra 25R型臺式高速離心機 美國Beckman Coulter公司;Wellscan MK3型酶標儀 美國雷博公司;Pannoramic MIDI全自動數字切片掃描系統 匈牙利3D HISTECH公司;r-911型全自動放免計數儀 中國科技大學實業總公司;722型分光光度計 上海分析儀器三廠;NR-B17CC型超低溫冰箱 日本松下;ISO9001型電子天秤 北京賽多利斯儀器系統有限公司;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;LEICA RM2016型病理切片機 德國RM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 動物實驗于北京體育大學運動營養實驗室完成。實驗過程中,實驗室溫度(22±2) ℃,相對濕度55%～75%,光照時間隨正常晝夜節律。大鼠以基礎飼料和蒸餾水常規飼養,自由飲食。

63只大鼠首先進行4 d適應性飼養,然后以20 min/d的運動量進行為期3 d的適應性游泳訓練,剔除不符合實驗要求的3只大鼠后,剩余60只大鼠以數字隨機分組法分為3組(直接標號法編號):安靜對照組(C組,12只)、過度訓練組(OM組,24只)和姜黃素+過度訓練組(COM組,24只)。訓練結束后,受訓練強度、頻度、負重情況、恢復時間等因素影響,OM、COM組大鼠出現死亡,分別剩余11只和14只。

1.2.2 營養干預與訓練方案 C組常規飼養,不進行任何運動及營養干預。OM、COM組采用8周遞增負荷游泳訓練,具體方案[18-19]詳見圖1。姜黃素用0.5%的羧甲基纖維素納配成混懸液,4 ℃存放備用。訓練過程中,對COM組大鼠進行姜黃素營養干預,根據文獻及預實驗確定姜黃素干預組劑量為200 mg/(kg·d)[20],灌胃體積為5 mL/kg,其余兩組灌胃等體積0.5%的羧甲基纖維素納,采用專業灌胃器每天灌胃一次。

圖1 大鼠游泳訓練方案

1.2.3 樣本采集 末次訓練結束24 h后,各組大鼠乙醚麻醉,頸總動脈取血,37 ℃自然凝固,待血清出現后,放入冰箱24 h后,4 ℃、3000 r/min離心10 min,得到上清液即為血清,置-20 ℃冰箱中保存待查。迅速取部分左心室心肌組織浸入4%多聚甲醛固定液中。同時,另取部分左心室心肌組織,置于預冷的生理鹽水中洗凈血污,準確稱量重量后按照1∶9的比例加入PBS緩沖液,以玻璃勻漿器在冰上充分研磨后進行超聲破碎。超聲在冰浴中進行,功率200 W,單次不超過3 s,根據破碎程度重復2～3次。破碎后經5000 r/min離心5 min取上層清液待測。

1.2.4 指標測試

1.2.4.1 心肌組織形態評價 將心肌組織從固定液中取出,流水洗滌12 h,將組織依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min 中脫水透明,石蠟包埋,制成4 μm切片,HE染色。在400倍光學顯微鏡下,進行心肌組織形態評價[21]。

1.2.4.2 血清T、Cor[21]和cTnI[22]的檢測 將分裝后的各組大鼠的血清按照試劑盒的相關步驟,采用放射免疫法進行血清T和Cor測定,并計算T/Cor比值;采用酶聯免疫吸附法進行血清cTnI測定。

1.2.4.3 心肌Nrf-2、HO-1、Bax、Bcl-2表達[21-22]采用免疫組化法檢測心肌Nrf-2、HO-1、Bax、Bcl-2蛋白表達。石蠟切片脫蠟至水經抗原修復后,加入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min后脫色洗滌3次進行血清封閉,隨后加入上述相應蛋白的一抗、二抗,進行DAB顯色,Harris蘇木素復染細胞核后脫水封片。每張切片隨機選擇5個高倍視野,每個視野100個細胞,根據細胞核著色程度和范圍進行H-score評分評定[23],其中深棕色為強陽性,棕黃色為中度陽性,淺黃色為弱陽性,藍色細胞核為陰性。H-score=(弱陽性細胞密度×1)+(中陽性細胞密度×2)+(強陽性細胞密度×3)。

1.2.4.4 心肌細胞凋亡指數[22]采用Tunel法檢測心肌細胞凋亡水平并計算細胞凋亡指數(H-score)。石蠟切片脫蠟至水,經修復、破膜后,將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合,覆蓋組織。切片平放于濕盒內,37 ℃孵育2 h后加入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育15 min。在converter-POD液中,37 ℃孵育30 min。洗滌,DAB顯色,Harris蘇木素復染細胞核后,流水沖洗,將切片依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min 中脫水,之后將切片拿出晾干,封片。采用Pannoramic MIDI病理切片掃描儀將每張切片內陽性的細胞數量及其染色強度轉化為相應的數值,應用公式計算H-score從而對其進行定量分析。每張切片隨機觀察5個高倍視野,每個視野100個細胞,其中細胞核呈深棕色為強陽性,棕黃色為中度陽性,淺黃色為弱陽性,藍色細胞核為陰性。進而對每個組織點進行識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的面積(單位:像素)和陽性百分比,最后進行H-score評分評定,H-score=(弱陽性細胞密度×1)+(中陽性細胞密度×2)+(強陽性細胞密度×3)。

1.2.4.5 心肌T-AOC、SOD活性和MDA濃度的檢測 將分裝后的各組大鼠的血清按照試劑盒的相關步驟,采用酶聯免疫吸附法檢測T-AOC、SOD活性以及MDA濃度[22]。

1.3 數據統計

所得數據用SPSS 20.0軟件進行分析處理,數據以均數±標準差表示,采用Shapiro-Wilk檢驗對數據進行正態分布檢驗,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時采用LSD法,方差不齊采用Tamhane法。p<0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組大鼠心肌組織形態

圖2顯示,C組心肌纖維著色均勻,肌纖維結構清晰,呈短柱狀,細胞境界清晰,細胞質呈紅色,細胞核呈藍黑色,且分布均勻。OM組心肌纖維著色明顯不均勻,結構不清晰,細胞境界模糊不清,心肌纖維出現腫脹,且有彎曲或斷裂現象。COM組心肌纖維著色呈均勻紅色,結構與細胞境界清晰,僅見心肌纖維出現輕度腫脹和彎曲。

圖2 各組大鼠心肌組織結構變化(HE,400×)

2.2 各組大鼠血清睪酮、皮質酮、肌鈣蛋白Ⅰ水平變化

T/Cor比值被認為是監控運動者機能狀況的敏感指標,可以有效反映機體合成和分解代謝的平衡情況[24]。以往的研究將T/Cor比值下降30%定為人體過度訓練的診斷標準[25]。本研究結果顯示(表1),OM組血清T極顯著低于C組(p<0.01),血清Cor極顯著高于C組(p<0.01);COM組血清T極顯著高于OM組(p<0.01),血清Cor顯著低于OM組(p<0.01)。組間T/Cor比值變化與T變化相一致,其中OM組大鼠T/Cor比值較C組下降達86.33%,證明本研究成功建立過度訓練動物模型。

表1 各組大鼠血清睪酮、皮質酮、肌鈣蛋白水平Table 1 Serum testosterone,corticosterone and cardiac troponin I levels between rats in each

cTnI是構成心肌肌鈣蛋白的三個亞基之一,僅在心肌中表達。正常情況下游離型cTnI僅在心肌細胞胞漿內少量存在,大部分cTnI則以復合體形式存在[26]。研究表明[26-27],長時程高強度運動可造成心肌出現氧化應激損傷,游離型cTnI迅速從受損細胞濾出造成其在血液中含量升高;同時,隨著心肌細胞凋亡增強,cTnI從復合體中分解,大量cTnI被釋放到血液循環中,高濃度的cTnI不僅可在運動后即刻出現,甚至可維持到運動后24h。由于cTnI具有高度的特異性和敏感性,其作為反映運動負荷是否造成心肌損傷的生物學標志物已被廣泛認可[28]。本研究結果顯示(表1),OM組血清cTnI極顯著高于C組(p<0.01),COM組顯著低于OM組(p<0.05),結合心肌組織形態出現一系列病理學改變,說明8周遞增負荷游泳訓練致大鼠過度訓練并引發運動性心肌損傷,而在訓練過程中補充姜黃素可以有效緩解心肌損傷的發生與發展。

2.3 各組大鼠心肌Nrf-2和HO-1表達變化

Nrf2被稱為抗氧化反應的“主要調節劑”,是調控細胞氧化應激反應的重要轉錄因子,同時也是維持細胞內氧化還原穩態的中樞調節者,通過與ARE相互作用,調節下游多種抗氧化基因的表達[29]。HO-1作為Nrf2下游靶標,廣泛參與Nrf2介導的抗氧化應答過程[30]。本研究結果顯示(表2,圖3),OM組心肌Nrf2表達與C組無顯著差異(p>0.05),HO-1表達顯著低于C組(p<0.05);COM組心肌Nrf2表達極顯著高于OM組(p<0.01),HO-1表達顯著高于OM組(p<0.05)。這一變化可能是由于長時程、高強度運動抑制了Nrf2和Keap1二聚體的解離過程,阻礙Nrf2進行核易位,導致HO-1表達減少。

圖3 各組大鼠心肌Nrf2和HO-1表達情況(TUNEL,400×)

表2 各組大鼠心肌Nrf2和HO-1的H-score結果Table 2 H-score of Nrf2 and HO-1 in myocardium between rats in each

而姜黃素作為Nrf2的激動劑,可以通過誘導Nrf2核易位,增強下游抗氧化基因表達,緩解心肌氧化應激狀態。本研究結果表明,補充姜黃素的COM組大鼠心肌組織Nrf2(p<0.01)和HO-1(p<0.05)表達水平極顯著/顯著高于OM組,這與多項研究結果是一致的。He等[31]的研究發現,姜黃素通過激活Nrf2及HO-1,有效改善高脂肪飲食誘導的小鼠肌肉氧化應激狀態。Zhao等[32]的研究中,姜黃素的預處理減弱了氧自由基生成,并顯著拮抗LO2肝細胞中葡萄糖氧化酶誘導的脂質過氧化。石瑤等[33]的研究表明,姜黃素通過上調HO-1活性,抑制氧化應激引發的心肌細胞損傷。這表明姜黃素可以通過激活Nrf2通路,上調Nrf2和HO-1表達水平,通過抑制氧化應激減輕細胞損傷。

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡水平及Bax和Bcl-2表達變化

Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的關鍵調節因子,包括以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡蛋白。這些蛋白之間動態平衡的輕微變化參與過度訓練誘導心肌細胞凋亡的發生與發展。Bcl-2/Bax比值的變化,決定細胞凋亡發生的走向[35]。本研究結果顯示(表3、圖4、圖5),與C組相比,OM組心肌細胞凋亡水平極顯著升高(p<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減弱(p<0.05),促凋亡蛋白Bax表達極顯著增強(p<0.01),Bcl-2/Bax比值極顯著降低(p<0.01)。上述結果說明,長時程、大強度致過度訓練引發氧化應激,Bcl-2/Bax比值降低,過度訓練大鼠心肌細胞凋亡加劇,引發運動性心肌損傷。

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡水平及Bax和Bcl-2的H-score結果Table 3 H-score of cardiomyocyte apoptosis and Bcl-2/Bax in myocardium between rats in each

圖4 各組大鼠心肌細胞凋亡水平(TUNEL,400×)

圖5 各組大鼠心肌Bcl-2和Bax表達情況(TUNEL,400×)

本研究還發現,COM組大鼠心肌細胞凋亡水平較OM組極顯著降低(p<0.01),Bcl-2表達極顯著增加(p<0.01),Bax表達極顯著減少(p<0.01),Bcl-2/Bax比值極顯著升高(p<0.01)。Calvert等的研究表明[36],提高Nrf2表達的穩定性可以升高Bcl-2水平,說明姜黃素可以通過上調Nrf2表達,改善心肌細胞凋亡狀態。Yang等[37]的研究中,使用姜黃素對大鼠心臟進行預處理,發現姜黃素可以通過上調Bcl-2表達、下調Bax表達,減少線粒體氧化損傷,進而改善缺血再灌注后的心肌功能。He等[38]的研究認為姜黃素可以通過促進Bcl-2易位至線粒體,抑制氧化應激,改善線粒體功能,從而降低藥物誘導的心肌損傷。本研究中,與OM組相比,COM組大鼠心肌病理學變化明顯減輕,血清T/Cor比值極顯著升高(p<0.01),cTnI水平顯著降低(p<0.05)。結合上述病理特征、損傷指標、氧化應激指標和凋亡指標的變化,說明補充姜黃素可以通過上調Nrf2、HO-1蛋白表達,提高SOD活性,有效緩解過度訓練及其引發的氧化應激狀態,上調Bcl-2,下調Bax,有效升高Bcl-2/Bax比值,抑制大鼠心肌細胞凋亡過程的繼續發展,發揮對心臟的保護作用。

2.5 各組大鼠心肌T-AOC、SOD活性及MDA濃度變化

長時程、高強度運動時,心肌細胞內還原型輔酶I氧化酶、黃嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶等活性增強,導致線粒體內活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成增多,大量的ROS除了引起線粒體本身發生損傷,還會引起整個心肌細胞氧化應激風險增加[34]。本研究結果顯示(表4),OM組心肌T-AOC和SOD活性極顯著低于C組(p<0.01),MDA濃度極顯著高于C組(p<0.01);COM組心肌T-AOC和SOD活性極顯著高于OM組(p<0.01),MDA濃度顯著低于OM組(p<0.05)。結合Nrf2和HO-1表達變化,表明長時程、高強度運動通過抑制抗氧化酶發揮生物學活性,誘導心肌氧化應激增強。Nrf2轉錄活性降低,造成其下游抗氧化蛋白HO-1的表達下降,機體抗氧化能力也隨之下降,脂質過氧化產物增多。而補充姜黃素通過上調Nrf2表達,增強HO-1表達,提高心肌T-AOC和SOD活性,引起MDA濃度顯著降低,改善了心肌抗氧化能力。

表4 各組大鼠心肌T-AOC、SOD活性及MDA濃度Table 4 T-AOC,SOD activity and MDA concentration in myocardium between rats in each

3 結論

本研究中,8周遞增負荷游泳訓練引發大鼠過度訓練,氧化應激加劇并加速心肌細胞凋亡,心肌組織形態發生病理性改變并出現功能異常。訓練過程中對大鼠以200 mg/(kg·d)劑量姜黃素進行營養干預,能夠通過上調Nrf-2(p<0.01),增加HO-1(p<0.05)表達,提高T-AOC和SOD活性(p<0.01),降低MDA濃度(p<0.05),有效緩解過度訓練的發生與發展及其引發的氧化應激狀態,從而引起抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加(p<0.01),促凋亡蛋白Bax表達減少(p<0.01),抑制大鼠心肌細胞凋亡(p<0.01),保護心臟組織結構和功能正常。