自然發酵駝乳對乙醇誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用

喬向宇,明 亮,伊 麗,何 靜,吉日木圖,2,*

(1.內蒙古農業大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古駱駝研究院,內蒙古阿拉善 750306)

急性酒精性肝損傷是酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)的早期發病形式,ALD的疾病譜包含單純的脂肪變性、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化以及肝細胞癌,這些病理變化能夠單獨存在順序發生,也可以同時存在或部分重疊[1]。一項基于全球2800萬人的流行病學調查結果顯示,飲酒是導致死亡(早逝)和傷殘調整壽命年(DALYs)的主要風險因素。2016年,全球有約280萬人因飲酒死亡,其中我國因飲酒導致的死亡人數就占其中的四分之一,遠遠高于其他國家[2]。細胞受損,炎癥應答,氧化應激[3],腸道內微生態失調[4]被認為是影響酒精性肝損傷的關鍵因素。

近年來,有研究者利用從自然發酵駝乳中分離的乳酸菌發酵鮮駝乳以及鮮牛乳,通過體外測定抗氧化能力發現,發酵駝乳具有更強的自由基清除能力,且抗氧化能力顯著高于發酵牛乳[5]。通過對益生菌的研究發現,其能夠用于預防和治療與腸道細菌產物相關和腸道泄露相關的疾病,其中,鼠李糖乳酸桿菌已經成功地應用于治療酒精誘導的大鼠肝損傷[6]。自然發酵駝乳中蘊含豐富的乳酸菌資源,在保護乙醇誘導的肝損傷方面還未有研究報道。

本實驗研究自然發酵駝乳對乙醇誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用,并從機體炎癥應答水平、肝臟氧化應激程度和脂肪變性三方面初步探討其發揮作用的機制,為進一步開發利用自然發酵駝乳提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級CD-1(ICR)小鼠 雄性,體重(21～23) g,許可證號:SCXK(京)2016-0006,飼養于本實驗室IVC動物實驗系統內,環境溫度(22±2) ℃,濕度50%～60%,小鼠自由進食和飲水,晝夜交替周期為12 h 北京維通利華實驗動物技術有限公司;自然發酵駝乳 內蒙古自治區巴彥淖爾市所屬的牧區;天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)測定試劑盒 北京九強生物技術股份有限公司;腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)等ELISA測定試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司;95%乙醇溶液(AR)、石蠟、甲醛、二甲苯、無水乙醇、氨水 上海國藥集團;蘇木素、伊紅 BASO公司;中性樹脂 北京索萊寶公司。

ZJ-4IVC動物實驗系統 蘇州馮氏實驗動物設備有限公司;2014-181Ab真空冷凍干燥機 上海東富龍科技股份有限公司;5810R臺式高速冷凍離心機 Eppendorf;3100全自動生化分析儀 Hitachi;Bead Ruptor12組織研磨勻漿儀 Omni;SynergyH1多功能微孔板檢測儀 BioTek;SQ2125石蠟切片機 Leica;PPTHK-21B攤片機 Leica;DS-Ri2顯微圖象分析系統 Nikon;GHP-9270隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;DK-8AX電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;FE28臺式pH計 Mettler;各型號微量加樣器 Eppendorf。

1.2 實驗方法

1.2.1 自然發酵駝乳的處理 本實驗所用自然發酵駝乳采自內蒙古自治區巴彥淖爾市所屬的牧區。新鮮駝乳經采集、簡單過濾后,65 ℃加熱30 min,并與約3%發酵好的自然發酵駝乳(老酸奶)混合均勻后敞口放置于環境中,自然發酵3 d之后采集樣品,樣品置于4 ℃冰盒中運送至實驗室。經測,自然發酵駝乳的滴定酸度為77.3 °T,pH為5.13。樣品經離心脫脂(3500 r/min,40 min)后,真空冷凍干燥成粉,存放于-20 ℃備用。

1.2.2 動物分組、給藥以及造模 24只ICR小鼠待其體重增長到(38±4) g時,隨機分為3組(每組8只),即正常組(NC)、模型組(MC)、自然發酵駝乳組(FCM)。NC組和MC組每日灌胃0.3 mL滅菌ddH2O;FCM組每日灌胃脫脂自然發酵駝乳粉溶液,按照6 g/kg(BW)的劑量計算并稱取自然發酵駝乳粉,溶于0.3 mL滅菌ddH2O中進行灌胃。每日灌胃2次,連續灌胃2周。造模最后一次灌胃結束后,禁食不禁水6 h,分3次按照總劑量為7.3 g/kg劑量灌胃體積分數為50%的酒精溶液進行造模,間隔1 h(見圖1)[7-9]。酒精灌胃結束后繼續禁食不禁水6 h,經異氟烷麻醉取血后,頸椎脫臼法處死小鼠進行取材。

圖1 造模流程圖

1.2.3 體重及臟器指數的測定 小鼠麻醉前,稱取體質量,取材后準確稱取小鼠肝臟濕重,按照下述公式計算肝臟指數:

1.2.4 血清指標(ALT、AST、TNF-α、IL-1β以及IL-6)的檢測 小鼠眼眶采血后,常溫下靜置4～6 h后離心分離血清(4 ℃,3000 r/min,20 min),用全自動生化分析儀測定血清中ALT和AST的活性,按照ELISA試劑盒說明書測定血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量。

1.2.5 肝組織相關指標的檢測 取約0.100 g肝組織,按照肝組織∶PBS=1∶9 (m/m)加入預冷的PBS(pH7.4),置于勻漿儀上進行冰浴勻漿,勻漿速度2.90 m/s,勻漿時間15 s。勻漿完畢后離心(4 ℃,3000 r/min,20 min)收集上清備用。上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠肝臟組織中MDA、SOD、GSH-Px、以及TG和TC的含量和活性。

1.2.6 肝臟組織病理學檢測 肝組織制作石蠟切片進行HE染色:將新鮮的肝臟左葉組織邊緣部分切除,PBS沖洗后,將中央均勻的組織切分為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小的組織塊,置于4%多聚甲醛溶液(PFA)中固定48 h。固定后的組織用PBS沖洗,去除殘留的固定液和雜質。依次用50%、70%、85%、95%以及無水乙醇進行梯度脫水,每個濃度下脫水2 h。脫水的組織經2次二甲苯透明、3次浸蠟后進行石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊制作為4～7 μm厚的石蠟切片,切片經脫蠟、脫水后進行HE染色,切片透明后用中性樹脂封片。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數和肝功指標的影響

表1的結果顯示,與對照組比較,模型組的ALT和AST水平極顯著增加(p<0.01),表明模型組的肝細胞受損,模型建立成功。模型組的肝臟指數較正常組有增大的趨勢,但是差異不顯著(p>0.05)。與模型組相比,自然發酵駝乳組的ALT水平顯著下降(p<0.05),AST具有下降趨勢,但沒有顯著性差異(p>0.05)。自然發酵駝乳組的肝指數低于模型組,但是高于對照組,三組之間均沒有顯著性差異。

表1 小鼠體重,肝臟指數及肝功指標Table 1 Mouse body weight,liver index and serum

2.2 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠機體炎癥反應的影響

圖2的結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著高于對照組(p<0.05或p<0.01),其中IL-1β和IL-6具有極顯著差異(p<0.01)。與模型組相比,自然發酵駝乳組小鼠TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量極顯著降低(p<0.01)。此外,自然發酵駝乳組上述三個指標的含量與正常組相比,均沒有顯著差異(p>0.05)。

圖2 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠體內炎癥反應的影響

2.3 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響

表2的結果顯示,模型組肝臟內的MDA含量極顯著高于正常組(p<0.01),這表明短時間內灌胃大量酒精后,小鼠肝臟內的脂質過氧化程度增加;而自然發酵駝乳組的MDA含量與模型組相比,顯著降低(p<0.05),這說明灌胃自然發酵駝乳能夠改善因單次大量飲酒所致的肝臟氧化應激水平的增加,能夠顯著降低肝臟內的氧化應激水平。與正常組比較,模型組小鼠肝臟內SOD的含量顯著降低(p<0.05),這可能是肝臟內氧化應激迅速增加，消耗了肝臟中發揮抗氧化作用的SOD所致;與模型組相比,灌胃了自然發酵駝乳組的小鼠體內SOD活性則顯著增加(p<0.05)。自然發酵駝乳組GSH-Px的酶活顯著高于模型組(p<0.05),模型組中的含量低于正常組,但差異不顯著(p>0.05)。上述實驗結果與Soleymanzadeh等[5]的實驗結果一致,說明自然發酵駝乳具有抗氧化作用。

表2 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of naturally fermented camel milk on liver MDA contents,SOD and GSH-Px activities in acute alcoholic liver injury

2.4 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟TG和TC的影響

由圖3可以得出,模型組小鼠肝臟中TG和TC的含量極顯著升高(p<0.01),這說明在肝細胞中有脂質的積累,這符合急性酒精性肝損傷早期的發病特征[10]。自然發酵駝乳組小鼠肝臟中的TG含量則極顯著降低(p<0.01),并且接近于正常水平;TC的含量有降低的趨勢但差異不顯著(p>0.05)。該實驗結果說明,灌胃了自然發酵駝乳后,能夠有效緩解短時間內大量飲酒所致的脂質在肝臟中的堆積情況。

圖3 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟TG和TC的影響

2.5 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學的影響

如圖4所示,光鏡下可見,正常組小鼠肝細胞排列較為整齊,肝小葉結構完整,未見明顯炎癥細胞(A);模型組肝細胞排列紊亂,具有明顯水腫現象,有大量炎癥細胞浸潤(圖中以箭頭標注),發生輕度脂肪變性(B);自然發酵駝乳組肝細胞排列較為整齊,無見明顯水腫現象,炎癥細胞浸潤明顯減少,脂肪變性程度減輕(C)。

圖4 自然發酵駝乳對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學的影響(HE，200×)

3 討論與結論

自然發酵駝乳是指以新鮮駝乳為原料,經乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發酵形成的酸性(主要是乳酸)含乳飲料[11]。具有很高的營養價值和保健功效,主要流行于非洲、阿拉伯國家、中亞、印度、蒙古國以及我國的新疆、內蒙古等地區[12],并深受當地居民喜愛。

早前報道,抗生素或者益生菌的施用能夠降低乙醇喂養的大鼠肝臟病變的嚴重程度[13-14]。自然發酵駝乳中益生菌種類豐富、數量巨大。張哲等[15]基于16S rRNA序列分析以及PacBio SMRT測序技術對內蒙古阿拉善盟傳統發酵乳制品進行研究,從中分離到8株乳酸菌和5株酵母菌,其中乳桿菌為優勢細菌屬,克魯維酵母菌屬為優勢真菌屬。孫天松等[16]對新疆伊犁地區和蒙古國采集的發酵駝乳中乳酸菌和酵母菌進行計數發現,其中乳酸菌數為6.45×107～1.13×109CFU/mL,酵母菌數為7.75×102～4.6×107CFU/mL。此外,Forsyth等[6]發現灌胃益生菌能夠預防和治療與腸道細菌產物相關的疾病并抑制腐敗菌的繁殖、增加腸道內益生菌的含量。長期灌胃益生菌數目巨大的自然發酵駝乳是否具有同樣的作用,仍需進一步研究。

促炎細胞因子TNF-α以及IL-1β在ALD中發揮重要作用[17-18]。近些年的研究表明,ALD小鼠的腸道微生態平衡被打破[19-20],腸道通透性的增加使得內毒素(LPS)進入機體[21],通過與肝臟Kupffer細胞表面的TLR4(Toll-like Receptor 4)結合后,通過一系列生物化學信號級聯反應[3,22]來促進上述細胞因子的釋放。本實驗的研究結果顯示,自然發酵駝乳能夠顯著降低乙醇誘導的酒精性肝損傷小鼠血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6炎癥因子的含量。該結果表明,自然發酵駝乳能夠逆轉急性酒精性肝損傷小鼠體內的炎癥應答情況,該實驗結果與小鼠肝臟病理切片HE染色的結果相吻合。

氧化應激是早期ALD的關鍵機制之一,大量研究表明,乙醇的攝入會導致氧化應激的增加,這個過程會產生脂質過氧化產物,如丙二醛、4,4-羥基壬烯醛等[23]和自由基,如ROS和1-羥乙基自由基(HER)等,這些都是具有肝毒性的物質。但是由于生物體內有抗氧化物質(包括抗氧化酶類、非酶抗氧化劑如GSH、維生素E以及維生素C等)的存在,使得機體有一定的抗氧化和自由基清除能力。Beermann[24]等研究發現,運用乳酸菌水解乳酪蛋白,能夠從中獲得具有抗氧化活性的物質。烏仁圖雅等[25]研究發現自然發酵駝乳能夠顯著降低小鼠血清、肝臟中MDA的含量,并提高肝臟、骨骼肌中T-SOD和GSH-Px活力,具有較強的抗氧化作用。本實驗我們發現,自然發酵駝乳組肝臟中MDA含量顯著降低(p<0.05),而SOD和GSH-Px的活性顯著增加(p<0.05)。該結果說明,自然發酵駝乳能夠抑制小鼠肝臟內脂質過氧化反應,并提高其抗氧化能力,改善氧化應激,進而減輕肝損傷。

此外,研究表明乙醇誘導的急性肝損傷前期氧化應激的增加,使得肝細胞內正常的脂代謝通路受到破壞[26-27],脂質在肝臟中的積累,進而發生脂肪變性。過氧化物酶體增殖物激活受體-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)是一種核激素受體,參與肝臟脂肪酸β氧化過程,并控制涉及脂肪轉運和氧化作用等一系列基因的轉錄,Zn元素被認為是PPAR-α的激動劑[10]。據報道,鮮駝乳中富含Fe、Zn、Cu等微量元素,其中以Zn元素的含量最高[28]。Bahobail等[29]和Meldebekova等[30]發現鮮駝乳經過發酵后Zn元素的含量增加,從0.8 mg/100 g增加到0.99 mg/100 g[29]。本實驗我們發現,自然發酵駝乳組小鼠肝臟中的TG含量明顯降低(p<0.01),結合肝組織病理切片結果也可以說明,自然發酵駝乳能夠減輕急性酒精性肝損傷前期的脂肪變性程度。我們推測,自然發酵駝乳中富含的Zn元素可能使其能夠促進肝臟內脂肪的氧化作用,進而促進脂質的轉運,并最終使得肝臟中TG的含量降低。

綜上所述,本實驗結果顯示自然發酵駝乳能夠保護小鼠肝臟免受乙醇誘導的肝損傷。這種保肝護肝作用可能是通過抑制小鼠體內的炎癥反應、改善小鼠肝臟氧化應激程度以及減輕小鼠肝臟脂肪變性程度,從而使得肝臟細胞的結構和功能恢復正常來實現的。本研究的不足之處在于,未明確自然發酵駝乳中發揮保肝護肝作用的具體成分以及自然發酵駝乳中微生物的種類和構成,這兩個問題有待進一步深入研究。