大豆異黃酮和牛初乳復合制劑對去卵巢大鼠骨質疏松癥的改善及抗氧化作用

郁 樺,常 萍,陳蓓旖,韋 蓉,馬麗娜,牛詩捷,甘 露,毛宇航,程光宇,4,*

(1.江蘇天美健大自然生物工程有限公司,江蘇南京 210046;2.南京師范大學中北學院,江蘇南京 210046;3.南京師范大學泰州學院,江蘇泰州 225300;4.南京師范大學生命科學學院,江蘇南京 210023)

骨質疏松癥是目前全球發病率、致殘率及醫療費用較高的疾患之一,是以骨量減少、骨質量受損及骨強度降低,導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病,被世界衛生組織列為三大老年疾病之一。隨著我國進入老齡社會,骨質疏松癥的發病率持續增高,全國大約有0.9億骨質疏松癥患者[1],其中絕經后婦女骨質疏松的概率約為80%[2]。目前,對于骨質疏松癥的防治多采用抗骨質吸收藥物,如鈣劑、降鈣素、雌激素等和促進骨形成藥物,如甲狀旁腺激素、類固醇等化學藥物進行聯合防治[3]。但有些藥物價格高,作用單一,有毒副作用,長期服用會對身體產生不利影響。近幾年,一些中藥及其復方制劑能促進骨形成,提高骨密度,在治療骨質疏松癥方面顯示了顯著療效[4]。我國動植物藥資源豐富,從中篩選出安全、高效的預防骨質疏松癥的天然制劑,是一種理想的防治方法。

大豆異黃酮是來自大豆的天然成分,具有雌激素樣作用,能有效預防婦女更年期的骨質疏松癥,同時也是良好的抗氧化物質。牛初乳凍干粉是奶牛分娩后7 d以內乳汁的凍干制劑,不僅含有豐富的人體必需營養物質,還含有免疫球蛋白、生長因子等多種生物活性物質。研究表明牛初乳凍干粉具有抗氧化和自由基清除作用[5],能促進胎鼠骨骼發育和成骨細胞增殖[6]。來源牛奶的一種抗氧化肽能預防氧化應激所致的成骨細胞功能紊亂[7]。超細鮮骨粉是優良的補鈣劑,生物吸收利用率高達60%～90%,其制劑對大鼠骨質疏松有改善作用[8]。最近的研究顯示,大豆異黃酮和牛初乳凍干粉在體內、外的實驗中具有較好的抗氧化特性[5,9]。利用大豆異黃酮、牛初乳凍干粉和超細鮮骨粉制備成復合制劑,已經初步顯示了能增加去卵巢大鼠的骨密度,對子宮有較好的抗氧化作用[10]。

研究表明,氧化應激是絕經后骨質疏松癥的重要發病機制[11],抗氧化劑能通過激活成骨細胞分化,抑制破骨細胞活性和骨細胞凋亡,誘導骨形成,預防去卵巢大鼠的骨質丟失[12]。因此,可通過使用有抗氧化活性的物質來提高機體抗氧化能力,達到防治骨質疏松的目的。抗氧化酶在機體的抗氧化系統中發揮著極其重要的作用,其在血漿和組織中的水平能反映機體氧化應激狀態和抗氧化能力,為骨質疏松的防治提供依據。但目前報道的主要是骨質疏松患者或動物血漿(液)的抗氧化能力,對其主要組織的抗氧化作用研究較少。

本文以大豆異黃酮、牛初乳凍干粉和超細鮮骨粉為原料制成復合制劑,通過測定活性氧清除作用,利用建立去卵巢動物模型模擬絕經后女性的骨質疏松,測定骨密度、礦質元素和血液、肝、腎、脾組織的抗氧化作用,進一步探討復合制劑對去卵巢大鼠骨質疏松癥的改善和抗氧化作用,旨在為具有增加骨密度功能的保健食品的開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆異黃酮和牛初乳復合制劑[簡稱復合制劑(SIBC)]組成成分為大豆異黃酮、牛初乳凍干粉和超細鮮骨粉,含量分析表明,SIBC中主要功能成分含量大豆苷為2.98%,大豆苷元為0.74%,染料木素為0.09%,染料木苷為0.7%,免疫球蛋白G為14.2%,蛋白質為31.0%,鈣為9.25%。SIBC人體推薦攝入量為1.4 g/人/d,即23.3 mg/kg BW/d,該樣品不以補鈣為主;實驗動物 健康雌性SD大鼠60只,清潔級,體重300 g左右,中國科學院上海實驗動物中心;飼料 參照AIN93飼料配方[13],配制成半成品飼料,用適當的物質替換飼料中來源于大豆的成分,以避免大豆異黃酮的植物雌激素樣作用對實驗的影響(飼料的成分和含量如下:酪蛋白:23.0%;DL-蛋氨酸:0.3%;玉米淀粉:32.0%;蔗糖:30.0%;纖維素:5.0%;玉米油:5.0%;混合礦物鹽:3.5%;混合維生素:1.0%;二酒石酸膽堿:0.2%);四乙氧基丙烷、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司;氯化硝基四氮唑藍(NBT)、水楊酸、硫代巴比妥酸、硝酸和高氯酸(優級純) 國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑 為國產分析純或生化試劑;AKP(堿性磷酸酶)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

HG9620A型原子吸收分光光度計 沈陽華光精密儀器有限公司;LUNAR EXPEERT #1117型雙能X線骨密度儀 美國LUNAR公司;Z36HK 型高速冷凍離心機 德國Hermle 公司;EV300型紫外可見分光光度計 美國Thermo fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 活性氧(ROS)清除作用的測定 取SIBC分別加入50 mmol/L的pH7.4和pH7.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)及生理鹽水,混勻,超聲處理20 min,于8000×g冷凍離心10 min,取上清液配成一定濃度的系列樣品提取液,以VC為陽性對照,按以下方法測定其ROS清除作用:

H2O2清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

1.2.2 大鼠骨質疏松模型的建立 按文獻[13]建立大鼠骨質疏松模型如下:大鼠經用30 mg/kg BW戊巴比妥鈉溶液麻醉后仰臥位固定,距劍突下約3 cm處剪毛,碘伏消毒,正中切開皮膚和腹肌,找到子宮,結扎輸卵管后依次切除雙側卵巢,分層縫合切口,最后經肌肉注射2萬U青霉素預防感染。大鼠去卵巢后逐只進行陰道涂片(1次/d),連續7 d,檢查去卵巢是否完全。取去卵巢手術的成功大鼠用于實驗。假手術組按同法進行手術,但僅切除一小塊脂肪,不切除卵巢。大鼠卵巢切除后恢復一周,進行分組和處理。實驗分為假手術組(對照組)、去卵巢組(模型組)、去卵巢加低劑量組(117 mg/kg,低劑量組)、去卵巢加中劑量組(233 mg/kg,中劑量組)和去卵巢加高劑量組(467 mg/kg,高劑量組),每組10只動物。實驗樣品用雙蒸水配制,每天經口灌胃給予(對照組和模型組給予與樣品體積相等的雙蒸水),連續灌胃90 d。實驗期間所有動物均飼喂配制飼料,自由攝食飲水,并定期測量體重。試驗結束時,尾部采血,4 ℃冰箱放置過夜,2500×g離心5 min,收集血清備用。處死動物后取其股骨,并分離組織分別進行骨骼和生化指標分析。

1.2.3 骨密度測定 動物處死后分離出左側股骨,用生理鹽水浸泡的紗布包裹,用雙能X線骨密度儀測定左側股骨中點和股骨遠心端骨密度。

1.2.4 骨和血清中礦物元素含量的測定 取大鼠右側股骨,剔去肌肉等軟組織后于105 ℃干燥至恒重,用分析天平稱量骨干重,用游標卡尺測量骨長度。樣品中骨Ca含量測定采用混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)消化法,按GB/T 5009.92-2003原子吸收分光光度法進行。血清磷含量測定采用磷鉬藍比色法,參考張龍翔等[17]方法。血清Ca、Zn含量測定同樣采用混合酸消化法,分別按GB/T 5009.92-2003和GB/T 5009.14-2003進行。

1.2.5 AKP 活性測定 血清AKP 活性測定按試劑盒說明書進行,結果以U/100 mL表示。

1.2.6 SOD活性測定 采用Stewert等[18]方法測定SOD活性。血液SOD測定時,取20 μL血液于1 mL含肝素的生理鹽水中混勻,3000×g離心5 min,棄上清液,保留沉淀的紅細胞,加蒸餾水0.2 mL 充分溶血,加入95%乙醇0.1 mL,振蕩30 s,加入三氯甲烷0.1 mL,再振蕩30 s,6000×g離心5 min,上清液用于SOD活性測定。組織SOD測定時,取組織剪碎后加入預冷50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.8),于冰浴中進行超聲波破碎(400 W,20 s×2),制備成10%勻漿,12000×g離心10 min,取上清液測定SOD活性。

1.2.7 MDA含量測定 取血和組織用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)分別制備10%溶血液和10%組織勻漿,2000×g離心10 min,取上清液用TBA比色法[13],以四乙氧基丙烷為標準測定MDA含量。

1.2.8 血脂含量測定 血清總脂、總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定分別按崔福生的香草醛微量法、鄰苯二甲醛測定法和鄰苯二甲醛顯色法[19]進行。

1.2.9 蛋白質含量測定 蛋白質含量測定采用Breadford法[20],以牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 SIBC對ROS清除作用的影響

圖1 SIBC的和H2O2(C)的清除活性

2.2 SIBC對去卵巢大鼠體重的影響

實驗期間,各組大鼠體重隨時間逐漸增加(表1),在實驗第30、60、90 d時,各去卵巢大鼠組體重顯著高于對照組(p<0.05);各去卵巢大鼠組在給予實驗樣品后,組間動物體重差異無顯著性。實驗結果說明SIBC對去卵巢大鼠體重的變化無顯著影響。

表1 SIBC對去卵巢大鼠體重的影響Table 1 Effects of SIBC on body weight of OVX

2.3 SIBC對去卵巢大鼠股骨Ca含量和骨密度的影響

造模后的模型組骨Ca含量和骨密度顯著低于對照組(p<0.05),表明去卵巢大鼠的骨質疏松模型成立。在給予SIBC后,低、中、高劑量組骨Ca含量分別比模型組提高4.4%、10.3%、11.6%,且中、高劑量組骨Ca含量與模型組相比有顯著性差異(p<0.05)。去卵巢大鼠的股骨中點及遠心端骨密度分別比對照組分別下降12.1%和16.6%,給予中、高劑量SIBC后,股骨中點及遠心端骨密度分別比模型組提高10.0%、10.9%和9.1%、9.4%,均有顯著性差異(p<0.05)。各組大鼠的骨干重和骨長測定無顯著性差異(見表2)。骨密度是評價骨質疏松的直接指標,骨密度降低反映了骨Ca量丟失,以上結果表明,SIBC對去卵巢大鼠的骨Ca丟失和骨密度降低有較好緩解作用。

表2 SIBC對去卵巢大鼠股骨Ca含量和骨密度的影響Table 2 Effects of SIBC on femur calcium content and bone density of OVX

2.4 SIBC對去卵巢大鼠血清礦質元素含量和AKP活力的影響

表3結果顯示,模型組血清Ca、Zn含量與對照組相比顯著下降(p<0.05),在給予SIBC后,與模型組相比,低劑量組血清Ca含量顯著增加(p<0.05),中劑量組血清Ca含量極顯著增加(p<0.01);中、高劑量組血清Zn含量均顯著增加(p<0.05)。造模后的模型組AKP活力極顯著高于對照組(p<0.01),在給予低、中、高劑量SIBC后,其AKP活力分別比模型組下降了34.2%、49.2%、35.7%,且與模型組相比,差異均有顯著性(p<0.05或p<0.01)。P含量在造模后低于對照組,但無顯著性差異,在給予SIBC后與模型組相比,未觀察到顯著性提高。可見,SIBC對去卵巢大鼠血清礦質元素的增加和AKP活力降低有一定的改善作用。

表3 SIBC對去卵巢大鼠血清Ca、Zn、P含量及AKP活力的影響Table 3 Effects of SIBC on content of serum Ca,Zn,P and AKP activity of OVX

2.5 SIBC對去卵巢大鼠SOD活性的影響

大鼠血液和組織SOD活性測定見表4。造模后模型組大鼠血液、肝、腎SOD活性與對照組相比顯著降低(p<0.05或p<0.01),提示大鼠去卵巢后抗氧化酶活性下降,自由基代謝平衡失調。當給予低、中、高劑量SIBC后,隨劑量的增加,SOD活性提高,且具有明顯的劑量依賴性,與模型組相比,中劑量組血液、腎SOD活性和高劑量組脾SOD活性分別提高了17.3%、8.0%和24.4%,差異顯著(p<0.05);高劑量組血液、肝、腎SOD活性分別提高了19.3%、12.5%和15.7%,差異極顯著(p<0.01)。說明SIBC能通過提高血液和主要組織的抗氧化酶活性,有效清除自由基,降低氧化應激反應,緩解去卵巢大鼠體內自由基代謝平衡的失調。

表4 SIBC對去卵巢大鼠血液和主要組織SOD活性的影響Table 4 Effects of SIBC on blood and main tissue SOD activity of OVX

2.6 SIBC對去卵巢大鼠丙二醛(MDA)含量的影響

模型組大鼠的血液及組織MDA含量升高,其中血液、肝MDA含量與對照組相比,有顯著性差異(p<0.05)。在給予SIBC后,中劑量組的血液和肝MDA水平分別比模型組下降了31.2%、30.6%,有顯著性差異(p<0.05),接近對照組水平;中劑量組的脾和高劑量組的肝、腎MDA也分別比模型組下降了19.8%、26.5%、18.6%,有顯著性差異(p<0.05)(見表5)。提示SIBC能降低MDA含量,對骨質疏松癥大鼠體內氧化應激所致的脂質過氧損傷有較好的抑制作用。

表5 SIBC對去卵巢大鼠血液和主要組織MDA含量的影響Table 5 Effects of SIBC on blood and main tissue MDA content of OVX

2.7 SIBC對去卵巢大鼠血脂的影響

SIBC對去卵巢大鼠血脂的影響結果見表6。造模后的模型組大鼠血清TC含量比對照組升高,HDL-C含量比對照組降低,有顯著性差異(p<0.05或p<0.01),提示造模后動物的血脂代謝異常。在給予SIBC后,中、高劑量組的TC含量比模型組分別降低了14.0%和15.8%,且差異顯著(p<0.05);低、中、高劑量組能極顯著地提高HDL-C水平(p<0.01),分別比模型組提高了23.3%、21.2%、17.2%。SIBC對總脂含量變化無顯著影響,但隨劑量增加有降低的趨勢。說明SIBC對去卵巢大鼠血脂水平有一定的調節作用,有利于骨質疏松病癥的改善。

表6 SIBC對去卵巢大鼠血脂的影響Table 6 Effects of SIBC on blood lipid of OVX

3 討論

3.1 SIBC能增加去卵巢大鼠的骨密度,抑制骨丟失,預防骨質疏松的發生

骨密度作為診斷骨質疏松和骨折危險程度的重要指標,目前被認為是反映骨質疏松的金標準[21],已經被廣泛應用在臨床診斷和動物實驗的研究中。血清Ca、P及AKP等是骨轉換的一些指標[22],當血清Ca、P偏低、AKP升高時可預測骨丟失,間接反映骨質疏松的一些病癥。本研究中大鼠去卵巢后骨密度和骨Ca及血清Ca、P下降,AKP活性升高。表明去卵巢后由于雌激素代謝失調,造成成骨細胞和破骨細胞的活性增強,骨吸收大于骨形成,骨代謝的平衡被破壞導致骨量丟失,形成骨高轉換型骨質疏松[23]。給予去卵巢大鼠SIBC后,能提高骨密度、骨和血清Ca水平,并能使升高的AKP活性恢復到正常值。補腎中藥方劑可預防去勢小鼠骨丟失,降低AKP水平[24],番茄紅素能提高去卵巢大鼠骨密度,升高血清Ca、P含量,降低AKP活性[25],橄欖油能有效緩解去卵巢大鼠的骨質疏松,提高血清Ca濃度,降低AKP活性,但對血清P含量無影響[26],與本實驗結果是一致的。說明SIBC不僅能增加骨密度,還可以通過調節骨轉換的一些指標,減弱去卵巢大鼠骨吸收強度,增強骨形成,對高轉換型骨質疏松有明顯抑制作用。

鋅參與骨骼的代謝,影響成骨形成[27],缺鋅可導致骨代謝障礙。同時,鋅也是CuZn-SOD的催化輔基。去卵巢大鼠血清Zn含量顯著下降(p<0.05),可能是導致SOD活性下降的原因之一。SIBC能顯著提高血清Zn含量,有助于維持正常骨代謝和抗氧化酶水平。

SIBC能降低骨質疏松的發生風險與其組分中的生物活性成分密切相關。染料木素是大豆提取物中具有雌激素樣活性最強異黃酮成分之一,在SIBC中它的含量為0.1%。染料木素在濃度1～100 nmol/L 時就可以表現出刺激ERα、β轉錄活性的作用,并且主要與骨骼ERβ結合,染料木素作用于ERβ產生的相對雌激素樣效應為作用于ERα時的30倍,能明顯改善去勢雄性大鼠血和尿的骨代謝生化指標[23],對去卵巢大鼠的骨密度、骨生物力學及相關生化指標都有改善作用[28],能有效預防絕經后婦女骨丟失[29]。牛初乳凍干粉含有多種調節骨代謝的生長因子,其中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)含量最高,檢測含量為1146 ng/g,其中80%以上是以游離態存在[5]。IGF-1是骨源性生長因子成分之一,能夠促進細胞的增殖分化,增強成骨細胞活性及其對鈣磷的吸收[1]。補充外源性骨生長因子可促進成骨代謝、改善骨結構、提高骨密度[30]。牛初乳提取物對成骨細胞增殖及胎鼠骨骼發育有促進作用,在促進骨骼發育方面的效果優于活性鈣,與其含有的IGF-1密切相關[6]。同時,SIBC含較高的免疫球蛋白(14.2%),能增強老年患者的免疫功能低下,減輕骨質疏松發生[31]。可見,SIBC中這些生物活性物質對預防骨質疏松起到了積極作用。

3.2 SIBC能清除ROS,降低體內氧化應激水平,有利于改善骨質疏松

SOD和MDA通常被作為用于評估氧化應激狀態的可靠指標[33]。當體內氧化應激水平增高,抗氧化酶活性降低,ROS清除能力下降,過多ROS導致體內脂質過氧化反應加劇,產生MDA增多,引起骨組織氧化損傷。SOD是細胞內主要的酶性抗氧化劑,能清除ROS,保護機體免受氧化損傷,在氧化與抗氧化平衡中起著重要作用[34]。MDA是脂質過氧化的終產物,已被廣泛作為ROS損傷脂質分子的一個標記物[35],間接地反映出細胞受損情況。本研究表明,去卵巢大鼠血液和組織SOD活性下降,MDA水平上升,說明去卵巢后導致了機體氧化應激反應發生。中、高劑量SIBC能提高去卵巢大鼠血液、肝、腎、脾SOD活性,降低血液、肝、腎、脾MDA含量。可見SIBC不僅在體外具有ROS清除活性,而且能清除體內自由基,減輕氧化應激所致的血液和組織氧化損傷,降低骨質疏松發生的風險。Ozgocmen等[36]研究顯示,骨質疏松患者紅細胞MDA含量顯著高于正常組。番茄紅素能增加去卵巢大鼠血清SOD活性,降低MDA含量[25]。Yalin等[37]發現,去卵巢鼠導致肝臟和腎臟中SOD活性下降,MDA水平上升。一些臨床研究顯示,骨質疏松患者血清MDA含量升高,而SOD等抗氧化劑的含量降低,提示骨質疏松發生時存在氧化損傷,體內氧化和抗氧化平衡被打破[38]。SIBC也同樣顯示了提高SOD活性、降低MDA含量,減輕去卵巢所致的氧化應激水平的作用。

研究表明,牛初乳提取物能提高老年人血清總SOD和Mn-SOD活性、降低脂質過氧化物水平[39],能提高血液SOD活性、降低心肌脂褐質合量[40],對吸收O3的小鼠具有抗自由基損傷作用[41]。最近研究顯示,牛初乳凍干粉具有清除自由基作用[5]。牛奶抗氧化肽能通過增加成骨細胞基因表達和抗氧化酶活性來促進成骨細胞分化[7]。SIBC中的牛初乳成分無疑增強了ROS清除能力,對改善去卵巢大鼠的自由基平衡失調和骨細胞的氧化損傷有積極的改善作用。

3.3 SIBC對脂代謝紊亂有一定的調節作用,能減輕骨質疏松發生的風險

近年來研究顯示,骨代謝和脂代謝存在著巨大關聯,當脂代謝平衡被打破時,會導致骨代謝紊亂,繼而引起骨質疏松、骨質流失和骨關節炎等骨代謝相關疾病發生[42]。本研究中去卵巢大鼠血清TC含量升高,HDL-C含量降低,提示造模后動物脂代謝異常。在給予SIBC后,能降低去卵巢大鼠血清TC含量,提高HDL-C水平。崔洪斌等[43]和史琳娜等[44]研究表明,大豆異黃酮能升高去卵巢大鼠血清HDL-C水平,降低血清TC水平。Potter等[45]對高膽固醇血癥絕經婦女的干預實驗顯示,大豆蛋白可使血漿TC下降,而HDL-C水平上升。Kim等[46]研究表明,牛初乳能降低2型糖尿病患者的TC和TG水平,Davis等[47]和王小軍等[5]在動物實驗中也顯示了牛初乳的降TC作用。可見,SIBC中的組分不僅對去卵巢大鼠的脂代謝紊亂能起到了一定的調節作用而且有利于降低骨質疏松發生的風險。

綜上所述,復合制劑在體外具有ROS清除作用,是一種理想的抗氧化劑。在去卵巢大鼠骨質疏松癥模型中,復合制劑能增加去卵巢所致的骨密度降低、提高血液和骨Ca水平,能增加血液和主要組織的抗氧化酶活性、降低脂質過氧化物含量,提高機體整體的抗氧化水平,同時,也能調節血脂代謝水平,對去卵巢大鼠所致骨質疏松癥起到積極的改善和抗氧化作用。