天然復合保鮮涂膜液對鹵鴨脖的保鮮效果研究

郗澤文,司昀靈,鄒立強,劉 偉

(南昌大學食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

醬鹵肉制品在國內發展歷史悠久,因風味和口感俱佳而備受消費者的喜愛[1]。然而由于長期以來的生產、銷售和消費習慣,醬鹵肉均以散裝、鮮食為主,使得人們對醬鹵肉制品的保鮮技術研究相對滯后[2]。

天然生物防腐劑如乳酸鏈球菌素(Nisin)、納他霉素等因具有安全、高效等特點已成為國內外食品保鮮領域的研究熱點[3]。Nisin是一種天然抗菌多肽,對大多數革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌效果,還具有較好的耐酸性以及在較低pH下的熱穩定性[4]。納他霉素是一種酯類抗真菌劑,是被FDA推薦的僅有的兩種生物防腐劑之一,對霉菌、酵母菌有抑制作用,但其無抗細菌活性[5]。此外,可食用膜在肉制品保鮮領域中有著獨特的優勢,可改變表面微氣調的環境,有效防止汁液流失和隔絕外界微生物,從而達到防腐保鮮的目的[6]。張曉春等[7]使用殼聚糖對鹵鵝表面進行了涂膜保鮮應用。海藻酸鈉具有良好的生物相容性和可降解性,且價格低廉、成膜性好,更重要的是已被國標允許添加在醬鹵肉制品中,較適合作為肉制品的可食性膜材料。

由于海藻酸鈉自身不具備抗菌性,故單獨使用涂膜效果較差[8]。Nisin對革蘭氏陽性菌,尤其是芽孢桿菌有很強的抑制作用,但它的抑菌譜較窄,因此可以與納他霉素抑菌譜互補發揮協同增效的作用。目前,采用復配保鮮涂膜液延長鹵鴨脖貨架期的研究鮮有報道,本文以不同濃度的海藻酸鈉、Nisin、納他霉素對鹵鴨脖進行保鮮處理,研究在儲藏過程中鹵鴨脖品質的變化,通過單因素實驗選出三種保鮮劑最優濃度,然后進行L9(34)正交實驗,進一步篩選得到最佳復合保鮮涂膜液,以期延長鹵鴨脖的貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹵鴨脖產品 江西煌上煌集團有限公司(經原料鴨脖、鹽腌、鹵制、攤涼、切割、氣調包裝等環節完成產品的制作過程,包裝盒內充N2)；Nisin、納他霉素 浙江銀象生物工程有限公司;海藻酸鈉、碘乙酸鈉、氯化鉀、2-硫代巴比妥酸、甲基紅、次甲基藍、氧化鎂等試劑 國藥集團化學試劑北京有限公司;平板計數培養基 青島海博生物技術有限公司;其它試劑 均為分析純。

PL602-L型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CR-400 色差計 日本柯尼卡-美能達公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;3110恒溫培養箱 美國Thermo Fihser科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 保鮮液的制備 稱取Nisin 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 g,分別溶于100 mL無菌水中,配制成濃度梯度為0～1.2 g/100 mL的Nisin保鮮液;稱取納他霉素0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g,分別溶于100 mL無菌水中,配制成濃度梯度為0～0.30 g/100 mL的納他霉素保鮮液;稱取0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g的海藻酸鈉分別加入100 mL無菌水中,70 ℃水浴加熱3 h至溶液呈均一狀態,冷卻至室溫后加入1.5%的甘油作塑化劑,得到濃度梯度為0～1.5 g/100 mL的海藻酸鈉保鮮液。

1.2.2 保鮮液對鹵鴨脖的保鮮處理 從4 ℃冷庫中取出當日生產的氣調包裝鹵鴨脖,在無菌操作臺中取樣分別浸沒保鮮液10 s,置于篩網瀝水瀝干,轉入聚乙烯袋真空包裝。所有樣品于4 ℃儲藏第9 d測定指標,每次實驗做三次平行。

1.2.3 單因素實驗 采用單因素實驗法,用不同濃度的Nisin、納他霉素、海藻酸鈉對鹵鴨脖進行保鮮處理,真空包裝后置于4 ℃儲藏第9 d取樣分別測定菌落總數、pH、TVB-N和TBARS值。海藻酸鈉濃度設置為0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g/100 mL;Nisin 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 g/100 mL;納他霉素濃度設置為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 g/100 mL。

1.2.4 正交優化實驗 為了得到最佳的天然復合保鮮涂膜液,在單因素實驗研究結果的基礎上,以L9(34)正交設計方法優化海藻酸鈉、Nisin與納他霉素的最優組合水平,樣品貯藏第9 d測定菌落總數、TBARS值、TVB-N值,作為保鮮效果的衡量指標。正交實驗因素水平設置見表1。通過直觀分析法得到影響測定指標的主次順序和最佳配比,并用方差分析其結果。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 驗證實驗 取當日生產的氣調包裝鹵鴨脖,在無菌操作臺中取樣浸沒于最優組合的涂膜液10 s,置于篩網瀝水瀝干,轉入聚乙烯袋真空包裝,對照組為相同體積的無菌水。在第1、4、8、12、15 d測定肉樣的菌落總數、pH、TBARS值、TVB-N值與色差值驗證正交實驗,篩選最佳復合保鮮涂膜液。

1.2.6 樣品測定前處理 于無菌操作臺中對鴨脖使用滅菌器械進行取樣。用手術鉗插入鴨脖中軸骨空心處以左手固定,右手持鑷子沿紋理方向從鴨脖表面撕下肉樣置于培養皿內,使用手術剪將其剪碎,備用待測。

1.2.7 指標測定

1.2.7.1 菌落總數的測定 參照GB 4789.2-2016食品安全國家標準 食品微生物菌落總數測定中的方法測定。

1.2.7.2 鴨脖pH的測定 準確稱取5.0 g肉樣,加入50 mL蒸餾水,剪碎后6000 r/min分散30 s后勻漿用pH計在室溫下直接測定。

1.2.7.3 鴨脖脂質過氧化(TBARS)的測定 參照Xiong等[9]略作修改。稱取10 g絞碎均勻的肉樣,加入50 mL 7.5%三氯乙酸(含0.1% EDTA),搖蕩30 min,過濾,取5 mL上清液,加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液并沸水浴加熱40 min,取出冷卻后離心(4000 r/min,20 min),取上清液并加入5 mL氯仿,搖勻靜置分層,取上清在 532 nm處比色。計算公式如下:

TBARS(mg/kg)=(A532/Ws)×9.48

式中:A532為待測液在532 nm下的吸光度值;Ws為肉樣品的質量(g)。

1.2.7.4 鴨脖揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照GB/T 5009.228-2016自動凱氏定氮法進行測定。

1.2.7.5 鴨脖色差的測定 參照Noori等[10]的測定方法。取各樣品鴨脖,使用色差計對鴨脖表面進行測定。自檢后使用白板進行標準校正,每個樣品隨機測定5點。色度坐標L*、a*、b*被記錄用于計算總色差值ΔE*。計算公式為:

1.3 數據處理

實驗中每組數據均進行3次重復,使用SPSS 22.0(SPSS Inc.,USA)進行數據的統計分析,并對實驗數據采用單因素方差分析(ANOVA)進行分析。當p<0.05時,認為組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉涂膜液最優濃度的確定

海藻酸鈉涂膜在第9 d時理化及菌落總數指標的結果見表2,使用0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g/100 mL 海藻酸鈉進行涂膜保鮮結果發現,空白組儲藏第9 d時,空白組各項指標已腐敗變質超標,而使用了海藻酸鈉可食用膜涂膜的實驗組各項指標均顯著優于空白組(p<0.05)。海藻酸鈉自身并不具備抗菌性及抗氧化性,從側面說明海藻酸鈉是通過可食用膜的形式覆蓋在鴨脖表面,使其具備一定的保鮮作用，抑制需氧菌的生長[11]。最優的指標分別為菌落總數對數值(5.14±0.14)lg CFU/g、pH6.10±0.08、TBARS(1.98±0.09) mg/kg、TVB-N(18.28±0.27) mg/100 g,出現在海藻酸鈉濃度為0.8～1.5 g/100 mL的實驗組,表明海藻酸鈉涂膜對鹵鴨脖有抑菌作用及抗氧化效果,其中1.0～1.5 g/100 mL的實驗組之間差異不明顯,表明濃度在1.0 g/100 mL時已基本達到最優濃度。且高于1.0 g/100 mL濃度后菌落總數有所升高。此外,海藻酸鈉作為多糖,也是一種微生物可以利用的碳源,且濃度過高會使得涂膜液變得粘稠。以上結論表明海藻酸鈉可食用膜具備一定的保鮮作用,且最優濃度為1.0 g/100 mL。

表2 不同濃度海藻酸鈉可食用涂膜保鮮的鴨脖第9 d的各項指標Table 2 Results for the 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of sodium alginate edible film

2.2 Nisin最佳濃度的確定

由表3可見,在第9 d時,空白組的各項指標分別為菌落總數對數值(6.06±0.10)lg CFU/g、pH5.47±0.06、TBARS(2.73±0.06) mg/kg、TVB-N(22.26±0.47) mg/100 g,已經不能食用。抗菌劑Nisin的抑菌效果非常顯著,由于Nisin對于細菌的抑制效果與有效濃度呈正相關[12],因此隨著濃度增大其抑菌效果越顯著(p<0.05),最大濃度Nisin的菌落總數對數值僅為(4.14±0.09)lg CFU/g。Nisin對于鴨脖微生物指標的影響進一步帶動理化指標的變化,在0.8 g/100 mL時的pH逐步上升至(6.11±0.09)。表明鴨脖中的優勢菌—乳酸菌被明顯抑制[1],pH較空白組有顯著性差異(p<0.05)。對于TBARS指標而言,Nisin濃度為0.8～1.2 g/100 mL時,組間差異不顯著(p>0.05);而對于TVB-N指標而言,當Nisin濃度大于1.0 g/100 mL時,組間差異不顯著(p>0.05)。結合測定指標與經濟效益,得出0.8 g/100 mL的Nisin為最佳濃度。

表3 不同濃度Nisin保鮮的鴨脖第9 d的各項指標Table 3 Results of various indexes for 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of nisin

2.3 納他霉素最佳濃度的確定

從表4中可以看出,采用0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/100 mL納他霉素實驗發現第9 d空白組已完全腐敗,而實驗組各項指標均優于空白組。隨著納他霉素濃度升高,保鮮效果逐漸增強,但較Nisin而言其保鮮效果較弱。在濃度最高為0.30 g/100 mL時的各項指標分別為菌落總數對數值(5.28±0.03)、pH(5.61±0.08)、TBARS(2.56±0.04) mg/kg、TVB-N(18.86±0.42) mg/100 g。納他霉素適用于表面滅菌,滲透性較差,且對真菌抑菌性顯著高于細菌,但引起鹵鴨脖腐敗變質的主要微生物為細菌[1]。此外,雖然實驗組各項指標顯著高于(或低于)空白組,但當濃度高于0.15 g/100 mL時實驗組間差異不顯著(p>0.05),結合測定指標與經濟效益,選擇0.15 g/100 mL作為納他霉素的最佳濃度。

表4 不同濃度納他霉素保鮮的鴨脖第9 d的各項指標Table 4 Results of various indexes for 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of natamycin

2.4 正交實驗篩選最優組合

在對海藻酸鈉、Nisin和納他霉素進行單因素實驗的基礎上,使用正交設計優化三因素三水平得到最優組合。在儲藏期間,以菌落總數、TBARS與TVB-N為評價指標進行分析。極差分析結果見表5,極差值(R)反映的是因素對檢測指標的影響程度,R值越大表明對保鮮效果的影響越大。TBARS與TVB-N對鹵鴨脖保鮮效果影響的因素順序:海藻酸鈉>Nisin>納他霉素。菌落總數對數值對鹵鴨脖保鮮效果影響的主次順序:Nisin>海藻酸鈉>納他霉素。從方差分析結果(表6)可以得出保鮮涂膜液對鹵鴨脖保鮮效果的顯著水平,以TBARS來觀察,海藻酸鈉影響極顯著(p<0.01),Nisin影響顯著(p<0.05);以TVB-N來觀察,各因素對實驗結果均有顯著影響(p<0.05),其中海藻酸鈉對TBARS與TVB-N實驗結果為極顯著影響(p<0.01)。以菌落總數對數值來觀察,只有Nisin具有顯著性影響(p<0.05),而納他霉素無顯著性影響(p>0.05)。根據表5各測定指標的K值確定各因素的最優水平組合。菌落總數:A2B3C3;TBARS:A3B3C3;TVB-N:A2B2C3。由于各項指標分析得到的最優組合均不一致,考慮到國家標準對于醬鹵熟肉制品僅明確了菌落總數的限制,而對TBARS與TVB-N未作規定,經綜合平衡分析[13],得到最優組合為A2B3C3,即海藻酸鈉 1.0 g/100 mL、Nisin 0.9 g/100 mL、納他霉素0.18 g/100 mL。

表5 正交實驗結果及直觀分析表Table 5 Results and visual analysis for orthogonal experiment

表6 L9(34)正交實驗方差分析表Table 6 Variance analysis of L9(34)orthogonal experiment

2.5 最優組合的可食用膜涂膜液的保鮮效果驗證

2.5.1 最優組合對鹵鴨脖冷藏期間菌落總數的影響 如圖1所示,菌落總數整體呈上升趨勢,最優組合的涂膜液對菌落總數有較大的抑制作用,最優組合顯著低于對照組鴨脖的菌落總數(p<0.05),在儲藏8 d時對照組的菌落總數對數值就已達到(5.69±0.11)lg CFU/g,遠超國家標準4.903 lg CFU/g[13]。而最優組合的菌落對數值僅為(4.49±0.07)lg CFU/g,低于國家標準,表明最優組合的可食用膜涂膜后的抑菌效果較好。到第12 d,由于微生物的大量繁殖,致使對照組較國家標準超出兩個數量級,而最優組剛達到國家標準上限值,其菌落總數對數值為(4.90±0.08)lg CFU/g,這與對照組相比差異顯著(p<0.05)。第15 d時，最優組菌落總數對數值為(5.37±0.08)lg CFU/g。最優組合中的海藻酸鈉形成的可食用膜隔絕了氧氣,抑制了需氧菌的生長。然而,據報道真空包裝對乳酸菌這一專性厭氧菌的生長有利[14],而Nisin能抑制乳酸桿菌屬在內的大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖。此外,菌落總數與TVB-N的趨勢相一致,可能是因為微生物的生長促進了蛋白質等營養成分的降解[15]。綜上,最優組合可以達到顯著抑菌保鮮的效果。

圖1 最佳復配組合對鹵鴨脖冷藏期間的菌落總數對數值的影響

2.5.2 最優組合對鹵鴨脖冷藏期間pH影響 乳酸菌是鹵鴨脖中的優勢腐敗菌[1],可以代謝產酸使pH下降,而蛋白質經微生物分解生成胺類物質則使pH上升。鹵鴨脖在冷藏期間pH變化情況如圖2所示,隨著時間的延長,兩組的 pH均呈現先下降后上升的趨勢,且對照組均顯著低于最優組(p<0.05),原因可能是脂肪酸化和糖原分解產酸,致使對照組鴨脖冷藏初期呈弱酸性[16];從第8 d開始,對照組 pH呈現顯著上升趨勢,可能是由于此階段的微生物快速生長,新陳代謝產生了堿性含氮物質如胺和三甲胺等，導致pH急速上升[15]。而最優組合pH的拐點也出現在第8 d,之后pH出現了顯著性增加(p<0.05)。從側面說明,最優組合的添加有效抑制了微生物的生長。在第12 d時,對照組的肉樣已經完全腐敗,大量繁殖的微生物促使對照組在8～15 d pH顯著增長(p<0.05),而最優組在第15 d時的pH為(5.85±0.06)與第4 d時無顯著性差異(p>0.05)。可見,最優組合可達到非常顯著的保鮮效果,這一實驗結果與李婷婷等[17]關于儲藏期間糖原經糖酵解產酸,而后微生物分解蛋白質等產生的堿性物質使其pH先下降后上升的研究結論一致。由此,可以看出最優組合對鹵鴨脖具有明顯的保鮮效果。

圖2 最佳復配組合對鹵鴨脖冷藏期間的pH影響

2.5.3 最優組合對鹵鴨脖冷藏期間TBARS值影響 從圖3可以看出,在儲藏期間,對照組與最優組合的TBARS值變化趨勢均與時間呈正相關,這可能是由于不飽和脂肪酸在氧的作用下發生了脂質氧化,其生成的醛和酮使得TBARS值升高[18]。在儲藏第1 d時,最優組合的TBARS值就已顯著低于對照組(p<0.05),兩組的TBARS值均呈顯著上升趨勢(p<0.05),并且對照組均顯著高于最優組(p<0.05),表明最優組合不僅在最初就表現出了抗氧化作用,在整個儲藏過程中都參與抑制脂質的過氧化。第15 d時，最優組TBARS值為(2.68±0.08) mg/kg。海藻酸鈉具有良好的成膜性,能夠有效阻隔氧氣接觸樣品,且復合涂膜液中的Nisin與納他霉素對微生物的抑菌作用進一步抑制了脂質氧化。可見,復合保鮮涂膜液可達到較好的保鮮效果。

圖3 最佳復配組合對鹵鴨脖冷藏期間的TBARS值影響

2.5.4 最優組合對鹵鴨脖冷藏期間TVB-N值的影響 由圖4可知,隨著時間的延長,兩組的TVB-N值均呈現上升的趨勢,并且對照組均顯著高于最優組(p<0.05),這可能是因為肉中蛋白質被降解為氨及胺類代謝產物的程度逐漸增大,使得揮發性鹽基氮值顯著升高[19]。初始時對照組與最優組的TVB-N含量均小于10 mg/100 g,對照組在第8 d時TVB-N值高達(18.76±0.63) mg/100 g,而最優組TVB-N值僅為(13.97±0.37) mg/100 g,說明最優組對鹵鴨脖的 TVB-N值的增長有抑制作用。直到第15 d最優組的TVB-N值僅為(20.86±0.79) mg/100 g,而對照組已達到(27.84±0.49) mg/100 g,表明最優組合有效抑制了產胺類微生物的生長。這與測定的菌落總數趨勢相一致。因此,與對照組相比,最優組合的復合保鮮涂膜液的保鮮效果較好。

圖4 最佳復配組合對鹵鴨脖冷藏期間的TVB-N值影響

2.5.5 最優組合對鹵鴨脖冷藏期間色差值的影響 如圖5所示,更高的ΔE*表示與原始色差相比變化較大。對照組在第8 d時ΔE*值為1.50±0.14,第15 d時ΔE*值高達2.34±0.13,與初始色澤變化顯著(p<0.05)。而最優組在冷藏第12 d仍能保持ΔE*值為1.40±0.04,最優組合的復合涂膜液有效地抑制微生物的生長,減少色澤的波動。海藻酸鈉可食用膜使鴨脖表面更加鮮亮,這是因為可食用膜隔絕了氧氣進一步阻止了脂質過氧化。第15 d時最優組的顏色呈深褐色,ΔE*值為1.51±0.07,汁液流失較少,而對照組已長出可見菌斑。由此可見,最優組合對延長鹵鴨脖貨架期有明顯效果,且不影響其外觀。

圖5 最佳復配組合對鹵鴨脖冷藏期間的色差值影響

3 結論

通過正交試驗獲得了三種天然保鮮劑的最優組合,結果表明復配使用后保鮮效果增強,天然保鮮劑Nisin 和納他霉素對海藻酸鈉可食用膜涂膜鴨脖的協同保鮮作用明顯,最優組合為海藻酸鈉 1.0 g/100 mL、Nisin 0.9 g/100 mL、納他霉素0.18 g/100 mL。鹵鴨脖在涂膜后冷藏第15 d菌落總數對數值、揮發性鹽基氮(TVB-N)、pH、TBARS和色差值分別為(5.37±0.08)lg CFU/g、(20.86±0.79) mg/100 g、(5.85±0.06)、(2.68±0.08) mg/kg、(1.51±0.07),均顯著優于對照組(p<0.05),最優組合能有效抑制鴨脖腐敗變質,保持肉樣新鮮度,延長鹵鴨脖冷藏貨架期。