四種原花青素含量測定方法比較

石 磊,高 哲,劉麗南,韓 巍,楊曉博,崔 同,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000;2.河北省保定市滿城中學(xué),河北保定 071000)

原花色素(proanthocyanidins,PC)是一類以黃烷-3-醇為主要結(jié)構(gòu)單元的縮合多酚類成分[1],存在于葡萄[2]、蘋果[3]、山楂[4-5]、草莓[6]、蓮[7]、高粱[8]、花生[9-10]、可可[11]等多種食用材料中,大量研究結(jié)果表明PC具有優(yōu)越的抗氧化[12]、清除自由基、心血管保護(hù)等一系列重要的保健生理作用[13-15],自上世紀(jì)80年代以來,PC提取物已經(jīng)成為功能性食品和化妝品的重要原料被廣泛應(yīng)用。

然而由于PC的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜[16],其相關(guān)產(chǎn)品的客觀表征始終是困擾市場質(zhì)量評價(jià)的技術(shù)難題[17],在國際上仍未形成統(tǒng)一的PC含量分析方法[18]。常見的分析方法包括分光光度法和高效液相色譜(HPLC)法,前者如基于PC酸解生成花青素的Bate-Smith法[19]、丁醇-鹽酸法(Porter法)[20]、芳香醛顯色的硫酸-香草醛法[21]、PC還原反應(yīng)的Folin-Ciocalteau法[22]以及鉬酸銨法等[23],后者包括側(cè)重多組分同時(shí)定量分析的直接HPLC法、側(cè)重組分識別分析的LC-MS法[24]、經(jīng)酸解生成花青素然后再經(jīng)HPLC定量的國標(biāo)分析方法[25],以及親核試劑芐硫醇存在下PC裂解后分析其降解產(chǎn)物的硫解-HPLC法[26]。這些方法的分析目的不同,定量分析原理不同,使用的對照(標(biāo)準(zhǔn))品通常也不盡相同,經(jīng)常會給出彼此矛盾的分析結(jié)果[27-28],而以往的文獻(xiàn)未見有針對不同方法進(jìn)行較系統(tǒng)的評價(jià)和比較。

本研究選擇的四種PC分析方法被廣泛應(yīng)用,且具代表性。其中有兩種分光光度法,為酸解原理各不相同的硫酸-香草醛法和鉬酸銨法,硫酸-香草醛法只適合于企業(yè)內(nèi)部同類產(chǎn)品的日常質(zhì)量控制等場合,而鉬酸銨法測定最為快速;正丁醇-鹽酸-HPLC法及硫解-HPLC法,這是兩種HPLC法,盡管檢測手段相同,但是酸解的方式也各不相同,目前正丁醇-鹽酸-HPLC法成為原花青素測定的國標(biāo)方法,還被美國藥典、我國商務(wù)部收錄,而硫解-HPLC法目前主要用于測定原花青素的平均聚合度。本研究將對這四種有代表性的PC分析方法進(jìn)行方法學(xué)上的評價(jià),并在此基礎(chǔ)上,通過對10家企業(yè)銷售的葡萄籽、葡萄皮、花生衣及松樹皮4類PC提取物共21份實(shí)際樣品進(jìn)行含量分析,歸納不同方法測定結(jié)果之間的相關(guān)性、應(yīng)用特點(diǎn)和局限性,為PC提取物的表征和質(zhì)量評價(jià)提供分析方法選擇方面的技術(shù)信息和科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽原花青素提取物樣品 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;所用PC提取物樣品 全部購自國內(nèi)市場,涉及陜西、江蘇、天津等地的10家供應(yīng)商提供的4類共21份產(chǎn)品,其中葡萄籽PC提取物樣品7份(編號1～7),葡萄皮PC提取物樣品3份(編號8～10),花生衣PC提取物樣品7份(編號11～17),松樹皮PC提取物樣品4份(編號18～21),采購時(shí)間為2017年3月,放置于防潮袋中加干燥劑冷藏備用;對照品兒茶素(CA)、表兒茶素(EC) 美國Sigma 公司;表兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,ECG) 上海同田生物科技有限公司;PC對照品 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;表兒茶素芐硫醚衍生物(EC-S)、表兒茶素沒食子酸酯芐硫醚衍生物(ECG-S) 由實(shí)驗(yàn)室分離純化制備,并經(jīng)LC-MS法、NMR法分析驗(yàn)證[26];芐硫醇 瑞士Fluka公司;流動(dòng)相用甲醇、乙腈 均為HPLC級,霍尼韋爾(中國)有限公司;其余試劑 均為分析純。

高效液相色譜儀 美國Waters公司,由1525型高壓二元梯度泵、2478型二極管陣列檢測器、柱溫箱以及Waters Breeze色譜工作站組成;色譜柱:Hypersil BDS-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國賽默飛世爾科技公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸-香草醛法

1.2.1.1 樣品液制備 精密稱取各PC提取物樣品10 mg,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶定容。

1.2.1.2 香草醛溶液配制 稱取3 g香草醛,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容。

1.2.1.3 硫酸甲醇溶液配制 準(zhǔn)確量取16.6 mL濃硫酸用甲醇稀釋,并于100 mL容量瓶中定容,配成30%的硫酸甲醇溶液。

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取PC對照品20 mg,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中定容,然后逐級稀釋配制成濃度分別為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL的系列溶液。準(zhǔn)確吸取0.5 mL各溶液加入比色管中,再加入2.5 mL香草醛溶液及2.5 mL硫酸溶液,混勻,在30 ℃恒溫下,避光反應(yīng)20 min,用分光光度計(jì)在500 nm波長下測定溶液吸光度,以各對照品溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5 樣品分析 另取0.5 mL樣品溶液代替對照品顯色分析,根據(jù)樣液的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中的濃度(mg/mL),進(jìn)而計(jì)算原始樣品中原花青素的含量(mg/mL)。

1.2.2 鉬酸銨分光光度法

1.2.2.1 樣品液制備 精密稱取各PC提取物樣品10 mg,加水溶解并定容至100 mL。

1.2.2.2 鉬酸銨溶液的配制 準(zhǔn)取稱取98.866 g鉬酸銨,加水溶解并定容至100 mL,配制成0.08 mol/L鉬酸銨溶液。

1.2.2.3 鹽酸溶液的配制 配制成1×10-4mol/L的鹽酸溶液。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取10 mg PC對照品,加水溶解并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中定容,然后逐級稀釋配制成濃度0.02～0.1 mg/mL 的系列溶液。于25 mL比色管中分別加入鉬酸銨溶液和對照品溶液各1 mL,用1×10-4mol/L的鹽酸定容至刻度線,搖勻,用紫外分光光度計(jì)在333 nm處進(jìn)行測定。以各對照品濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 樣品分析 另取1 mL樣品溶液代替對照品溶液按上述方法顯色分析,根據(jù)樣液的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中的濃度(mg/mL),進(jìn)而計(jì)算原始樣品中原花青素的含量(mg/mL)。

1.2.3 正丁醇-鹽酸-HPLC法

1.2.3.1 樣品液制備 準(zhǔn)確稱取各種PC提取物樣品50 mg,用30 mL甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,超聲5 min,冷卻后用甲醇定容待用。

1.2.3.2 酸解顯色 反應(yīng)于具塞試管中,依次加入15 mL正丁醇-鹽酸(95∶5,V/V)溶液、0.5 mL硫酸鐵銨溶液(2 g硫酸鐵銨用100 mL的2 mol/L鹽酸溶解定容)和2 mL樣品溶液,混勻,沸水浴回流40 min,冷卻,過0.45 μm濾膜,待HPLC分析。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取PC對照品10 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,吸取上述對照品溶液用甲醇稀釋配制10、25、50、100、150 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液。各取2 mL按上述方法顯色。

1.2.3.4 HPLC分析條件 色譜柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:水-甲醇-異丙醇-甲酸(73∶13∶6∶8,V/V);流速:1.0 mL/min;檢測波長:525 nm;進(jìn)樣量:10 μL。以樣品液分析的色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中PC濃度(μg/mL),再以此求出樣品中的含量(μg/mL)。

1.2.4 硫解-HPLC法

1.2.4.1 樣品液制備 精密稱取各種PC提取物20 mg,用無水乙醇溶解,定容10 mL。

1.2.4.2 硫解反應(yīng) 反應(yīng)A液:5%芐硫醇乙醇溶液;反應(yīng)B液:1 mol/L鹽酸∶冰醋酸(1∶50,V/V)。吸取100 μL反應(yīng)A液、50 μL反應(yīng)B液、100 μL樣液,放入安培瓶中密封,在90 ℃水浴中反應(yīng)60 min,立即冷卻,用于HPLC分析。

1.2.4.3 HPLC分析條件 流動(dòng)相:A為500 μL/L 甲酸溶液;B為甲醇∶乙腈(1∶2,V/V),含500 μL/L的甲酸;梯度洗脫程序:0～8 min 13% B,14 min 40% B,24 min 50% B,27～34 min 100% B,37～45 min 13% B;流速:0.8 mL/min;柱溫度:35 ℃;二極管陣列檢測波長:280 nm;進(jìn)樣量:5 μL;峰面積外標(biāo)法定量。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)對照品CA、EC、ECG、EC-S、ECG-S,用甲醇配制系列標(biāo)準(zhǔn)液。按上述 HPLC分析條件進(jìn)樣分析,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.5 PC含量及平均聚合度(mDP)計(jì)算公式 樣品中PC總含量,以CA、EC、ECG、EC-S、ECG-S 5種成分的含量之和來表示。

mDP=(CCA+CEC+CECG+CEC-S+CECG-S)/(CEC+CCA+CECG)

式中:CCA、CEC、CECG、CEC-S和CECG-S分別為樣品溶液中CA、EC、ECG、EC-S和ECG-S的摩爾濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分析方法間一般指標(biāo)的比較

2.1.1 回歸方程與線性相關(guān)系數(shù) 采用4種PC定量分析方法,配制PC系列標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行分析,根據(jù)測定結(jié)果制作各方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程見表1。由表1可知,幾種方法在評價(jià)范圍內(nèi)表征PC含量的響應(yīng)值(Y)與樣液的質(zhì)量濃度(X)間有良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)均在0.999以上。

表1 原花青素不同定量分析方法的比較Table 1 Comparison of different quantitative analysis methods of PC

2.1.2 靈敏度 兩種分光光度法中硫酸-香草醛法的檢出限(LOD)更低,為鉬酸銨法的0.4倍左右。兩種HPLC法中硫解-HPLC法的LOD值比正丁醇-鹽酸-HPLC法明顯更低,但考慮到它反映的是硫解反應(yīng)之后的單體成分的而非直接反映PC含量,要想得到PC含量,還需將硫解反應(yīng)后的單體成分的摩爾濃度進(jìn)行加和,計(jì)算得到PC含量,所以在實(shí)際分析應(yīng)用中兩種方法靈敏度相當(dāng)。

2.1.3 精密度 1 mg/mL的對照品重復(fù)測定(n=5),考查方法的精密度,由表1中的結(jié)果可見,兩種分光光度法RSD相近。而兩種HPLC法,尤其是硫解-HPLC法的精密度更高。

2.1.4 加標(biāo)回收率 精確稱取葡萄籽原花青素提取物樣品10、10、50、2 mg(n=5),測定其中PC含量。另外再分別取葡萄籽原花青素提取物樣品5、5、25、1 mg(n=5),在前三個(gè)方法中分別加入PC對照品417、214、550 mg/g(干重),在最后一個(gè)方法中加入混合對照品CA、EC、ECG、CA-S、EC-S、ECG-S,加入量分別為37、13、5、19、98、24 mg/g(干重),按方法分別測定加標(biāo)樣品中PC含量,計(jì)算各樣品的加標(biāo)回收率,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。可見兩種分光光度法中,硫酸-香草醛法較鉬酸銨法回收率稍低,因?yàn)榱蛩?香草醛法的反應(yīng)環(huán)境為30 ℃、20 min,而鉬酸銨法是在樣品中加入試劑直接通過分光光度法測定,兩種方法相比,鉬酸銨法更快速,誤差較小,而硫酸-香草醛法在反應(yīng)體系中可能會存在少量能夠影響對照品顯色的成分。而兩種HPLC法中,基于花青素分析的正丁醇-鹽酸-HPLC法回收率更高,而采用硫解-HPLC法幾種降解產(chǎn)物的加標(biāo)回收率均未達(dá)到95%,其原因是,黃烷醇類化合物對照品在酸性加熱的硫解反應(yīng)體系中并非很穩(wěn)定,會發(fā)生一定程度的降解,從回收率的數(shù)據(jù)中可以看出,兒茶素的回收率相對最低,表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的回收率較高,說明其穩(wěn)定性要好一些,這與以往的研究結(jié)果一致[26]。芐硫醚衍生物的回收率普遍偏低,這是今后要進(jìn)一步探討的問題,應(yīng)該根據(jù)可靠的回收率數(shù)據(jù)得到校正系數(shù)帶入PC含量計(jì)算公式。

2.2 供試液的穩(wěn)定性

以葡萄籽原花青素提取物樣品為試樣,對各顯色反應(yīng)、衍生反應(yīng)后供試液的穩(wěn)定性進(jìn)行考查,結(jié)果見圖1。可以看到鉬酸銨法和硫解-HPLC法的供試液比較穩(wěn)定,至少在10 h之內(nèi)變化不大,正丁醇-鹽酸-HPLC法生成的花青素濃度稍有下降,而硫酸-香草醛法在顯色反應(yīng)結(jié)束后3 h內(nèi)不夠穩(wěn)定,原花青素表觀含量會逐漸下降。由表2方差分析可得知,同一方法不同的時(shí)間之間測得供試液穩(wěn)定性差異不顯著,同一時(shí)間不同的方法之間測得的供試液穩(wěn)定性差異顯著(p<0.05)。

圖1 不同方法供試液穩(wěn)定性

表2 不同方法供試液穩(wěn)定性的方差分析Table 2 Analysis of variance of test solution stability by different methods

2.3 不同方法測定21份樣品的PC含量

采用硫酸-香草醛法、鉬酸銨法、正丁醇-鹽酸-HPLC法和硫解-HPLC法,對市售的葡萄籽、葡萄皮、花生衣及松樹皮的PC提取物共計(jì)21份樣品進(jìn)行測定,其含量和平均聚合度分析結(jié)果如表3所示。由各方法測定結(jié)果的平均值可知,正丁醇-鹽酸-HPLC法最高為40.24%,硫酸-香草醛法的結(jié)果與其接近為38.70%,鉬酸銨法為18.80%,明顯偏低,而硫解-HPLC法更低,只有8.39%。出現(xiàn)這種結(jié)果的主要原因,是這些分析方法基于完全不同的分析原理,詳見討論部分。

就每種方法而言,不同原料的PC提取物所獲得的“平均值”是有差異的,比如香草醛法測定的幾種松樹皮提取物,其平均值為29.04,較之其他原料的平均值明顯偏低。正丁醇-鹽酸-HPLC法的結(jié)果也有相似的趨勢,但鉬酸銨法和硫解-HPLC法的結(jié)果卻不同。所以在不同分析方法之間,這種不同原料間差異的表現(xiàn)也不盡相同。如表4所示,方法、樣品以及兩者的交互作用,都對原花青素含量的影響達(dá)到了極顯著的水平。

表4 不同測定方法所得原花青素含量的方差分析Table 4 Analysis of variance of PC contents with different methods

針對這21份樣品的檢測結(jié)果,對4種不同方法所得結(jié)果彼此間的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,如表5所示,結(jié)果表明,硫酸-香草醛法與正丁醇-鹽酸-HPLC法的結(jié)果之間相關(guān)系數(shù)最高,為0.5311大于p0.05=0.433,小于p0.01=0.549,即兩者的相關(guān)性水平達(dá)到顯著而未達(dá)到極顯著。此外兩種HPLC法之間相關(guān)系數(shù)為0.4001,接近但未達(dá)到顯著水平,其他4種對比組合的相關(guān)系數(shù)均不足0.2,說明用不同方法所得檢測結(jié)果之間相互印證的效果不明顯。

表5 方法間的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)Table 5 Correlation statistics between methods

最后,采用硫解-HPLC法還得到了21份樣品PC的平均聚合度,結(jié)果見表3,可以看出葡萄籽和松樹皮的PC聚合度較低,葡萄皮的稍高,花生衣PC聚合度最高。而且來自不同廠家的樣品之間差異很大。

表3 四種原花青素分析方法對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果(%)Table 3 Test results of four PC analysis methods on actual samples(%)

3 結(jié)論與討論

作為植物多酚中組成和結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一類,原花青素一直是植物活性成分定量分析領(lǐng)域最具挑戰(zhàn)的分析課題之一。本試驗(yàn)選擇了4種不同原理的典型分析方法進(jìn)行考察,從一般指標(biāo)的比較來看,4種方法的線性相關(guān)性、靈敏度、精密度和加標(biāo)回收率均能滿足常規(guī)分析,在良好操作的前提下,方法的穩(wěn)定性也可以得到保證,但是在應(yīng)用于不同來源的實(shí)際樣品分析時(shí),不同方法所獲得的檢測結(jié)果之間表現(xiàn)出顯著的差異。分析其可能的原因如下:

首先,4種方法的原理不同。硫酸-香草醛法[21]是利用黃烷醇分子上A環(huán)具有間苯三酚結(jié)構(gòu),在酸性條件下與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng),生成紅色衍生物,從而進(jìn)行定量分析。這種方法的特點(diǎn)除了操作簡單和重現(xiàn)性較好之外,最突出的特征是廣譜性,不僅PC聚合物上的所有黃烷醇單元、游離的黃烷醇單體(按定義其不屬于PC),甚至樣品中同樣具有間苯三酚結(jié)構(gòu)的黃酮類雜質(zhì)也會發(fā)生顯色反應(yīng)。因此這種分析方法特異性不強(qiáng),只適合于企業(yè)內(nèi)部同類產(chǎn)品的日常質(zhì)量控制等場合。

鉬酸銨分光光度法是基于鄰苯二酚與鉬酸銨在弱酸條件下可以生成黃色鉬酸酯,從而建立的一種紫外分光光度法。黃烷醇的C環(huán)上通常具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu),因此可與鉬酸銨發(fā)生類似反應(yīng)[23]。然而植物提取物中的其他多酚,比如一些黃酮、酚酸等成分同樣含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu),所以此方法的特異性不強(qiáng)。此外這種方法的顯色條件對溶液的pH比較敏感,所以在實(shí)際應(yīng)用方面,除作為快速檢測之外,這種方法出現(xiàn)頻率較低。

文獻(xiàn)報(bào)道的另一種常用的分光光度法,是基于經(jīng)典的Bate-Smith法[19],后經(jīng)Porter等優(yōu)化形成了現(xiàn)在比較流行的鐵鹽催化-正丁醇-鹽酸法[20]。即在正丁醇的鹽酸溶液中,通過加熱將PC的延伸單元降解下來,并以三價(jià)鐵離子為氧化劑將生成的正碳離子中間體氧化成較穩(wěn)定的花青素,最后通過分光光度法進(jìn)行定量分析。本文評價(jià)的HPLC法,是在此酸解反應(yīng)的基礎(chǔ)上,通過HPLC法測定生成的花青素,使方法的特異性更強(qiáng),成為目前的GB/T 22244-2008《保健食品中前花青素的測定方法》[25],此外美國藥典[29]以及我國商務(wù)部頒布的《葡萄籽提取物》標(biāo)準(zhǔn)[30]也收錄了該方法。由于這兩種方法的機(jī)理近似,所以本文選擇HPLC法進(jìn)行了評價(jià)。該方法的最顯著優(yōu)點(diǎn)是具有較高的準(zhǔn)確性[30],因?yàn)樵摲磻?yīng)體系幾乎可以排除非PC類物質(zhì)生成花青素的假陽性干擾。但是需要強(qiáng)調(diào)一點(diǎn),這種方法的結(jié)果僅僅反映了PC延伸單元的含量,而其“末端”結(jié)構(gòu)單元在酸解條件下生成了無色的黃烷醇,所以沒有被包括,因此在用PC對照品制做標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品分析結(jié)果時(shí),與對照品相比,平均聚合度較高的樣品所得分析結(jié)果會偏高,而聚合度較低的樣品則會比真實(shí)結(jié)果偏低。其次這種方法的另一個(gè)不便在于,PC的酸解反應(yīng)生成花青素的產(chǎn)率仍不夠高,這就必須要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件以獲得良好的重現(xiàn)性。此外,參考標(biāo)準(zhǔn)品沒有直接選用反應(yīng)產(chǎn)物花青素,而是與前兩種分光光度法一樣選用“原花青素對照品”,因此這種分析方法測得的分析結(jié)果僅具有相對含義,表示樣品中原花青素酸解生成花青素的含量相當(dāng)于對照品的百分?jǐn)?shù),這不等于PC的絕對含量,其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至少還取決于對照品的真實(shí)純度。這是造成目前行業(yè)中“原花青素含量”概念比較混亂的一個(gè)重要原因。

很早就有學(xué)者發(fā)現(xiàn),PC在酸解過程中其延伸單元首先生成不穩(wěn)定的正碳離子中間體,隨后它可以與親核試劑如芐硫醇結(jié)合,生成相應(yīng)的黃烷醇4-芐硫醚衍生物,反應(yīng)中PC最末端的結(jié)構(gòu)單元?jiǎng)t生成相應(yīng)的黃烷醇分子[1]。這種方法在早期常被用于PC類成分的鑒別和結(jié)構(gòu)分析,后來與HPLC法相結(jié)合開發(fā)出了定量的硫解-HPLC分析方法[31],從反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖可以清楚地看到,原來堆積在一起的PC聚合物的寬峰已經(jīng)消失,只剩下為數(shù)不多的幾個(gè)衍生產(chǎn)物成分,譜圖變得十分簡潔[31]。這不僅為可靠的外標(biāo)定量分析法提供了良好的前提條件,而且另一個(gè)好處是通過統(tǒng)計(jì)硫醚衍生物與黃烷醇的分子比例(可由峰面積求得),可以計(jì)算出樣品PC的平均聚合度,這對于評價(jià)PC的質(zhì)量來說非常重要。然而制約這種分析方法準(zhǔn)確性的因素有兩方面,其一是PC化合物的結(jié)構(gòu),有報(bào)道發(fā)現(xiàn),黃烷醇之間以4～8位C—C連接的化學(xué)鍵比較容易斷裂,4～6位連接就比較牢固,而A型的縮合方式最難斷裂。因此不同植物來源、制作方法生產(chǎn)的各種PC,是否能夠被徹底解聚是一個(gè)需要探討的問題;另一方面,生成的硫解產(chǎn)物在反應(yīng)體系中是否穩(wěn)定,各種成分的再分解程度到底如何仍需研究。以往曾在山楂PC的硫解-HPLC分析中嘗試過引入硫解反應(yīng)系數(shù)[32]來進(jìn)行校正,但更系統(tǒng)的研究尚未見有價(jià)值的報(bào)道,因此本文中也暫時(shí)參照文獻(xiàn)的方法,以理論值來計(jì)算。這是造成分析結(jié)果較真實(shí)含量偏低的一個(gè)原因。

不同方法結(jié)果不太一致的另一個(gè)原因還取決于樣品的品質(zhì),如果樣本群體PC含量普遍較高,雜質(zhì)成分很少,它對分析結(jié)果的干擾程度就會降低,不同方法之間的相關(guān)性就會提升。本研究所獲得的這些樣品是從市場隨機(jī)抽取的,從整體檢測結(jié)果來看PC含量偏低,這也從側(cè)面反映出,開發(fā)更準(zhǔn)確的分析檢測方法,以建立較完善的產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)體系,是本領(lǐng)域需要繼續(xù)解決的研究課題。