液相色譜-串聯質譜法測定糖果中2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉甜味抑制劑

陳 桐,周洪斌,*,王現平,肖 震,陸慧媛,李 平,沈偉健,王 紅

(1.鎮江海關,江蘇鎮江 212008;2.南京海關動植物與食品檢測中心,江蘇南京 210001)

在食品加工過程中,糖可以增加甜味,還可以起到增稠、發色、護色、改善質地、定型、防腐、裝飾等作用。但是,加入糖過多會使食品甜度太高;而減少糖的使用量,會使食品其他特性發生改變,達不到理想效果[1]。而甜味抑制劑可以解決上述問題,可通過遮蔽味蕾細胞上的甜味受體,調節甜味感知度,起到降低甜味的作用[2-3]。甜味抑制劑又稱為“降甜劑”、“遮甜粉”、“降糖香精”,最早由美國發明,主要用于高糖食品,起降低甜味的作用。2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉(Sodium 2-(4-methoxyphenoxy)propionate)是甜味抑制劑中的有效成分,為白色或淡奶油色晶狀固體,可從匙羹藤、棗葉、咖啡豆等植物中提取[4],也可人工合成,對蔗糖、果糖、葡萄糖、阿斯巴甜、糖精鈉等12中甜味劑甜味抑制效果較好。但是,2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉只是通過改變味覺,降低了甜味,并沒有降低食品本身的含糖量,這樣就有可能使人在不知不覺中攝入過量的糖,對人體造成危害[5]。

雖然2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉作為一種食品添加劑被收錄在GB 2760-2014“允許使用的食品用合成香料名單”中[6],但相關部門還未制定使用限量和統一的檢測方法及標準。目前,文獻報道的食品中2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉的檢測方法較少,主要有液相色譜法和氣相色譜法。陳毓芳等[7]也提出了高效液相色譜法測定糖果中2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸鈉的方法。該方法前處理簡單,重現性好。張翠芬等[8]利用氣相色譜技術對含糖食品中的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉進行檢測,方法的檢出限為0.4 g/kg,平均回收率為94.8%～101.7%,相對標準偏差為3.6%～4.6%。高液相色譜法和氣相色譜法在實際檢測樣品過程中,主要依靠保留時間定性,峰面積定量,一旦目標化合物色譜峰附近出現其他未知干擾峰而較難分離時,會影響目標化合物的定性與定量,造成假陽性結果。而高效液相色譜-串聯質譜技術(High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)是通過離子碎片對樣品進行定性和定量分析,可排除干擾,且具有較高的靈敏度,通常比HPLC法檢出限低3～4個數量級,能夠滿足微量和痕量成分測定要求[9-13]。

因此,本研究擬采用HPLC-MS/MS技術測定含糖食品中的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉,通過對色譜、質譜以及提取溶劑等條件的優化,建立準確的定性和定量方法,為國家相關食品監管和風險監測提供可靠的依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸(質量分數≥98.0%) Sigma公司;乙腈、正己烷、甲醇 色譜純,Merck公司;氨水、甲酸 分析純,國藥集團,上海;水相膜 0.22 μm,上海安譜公司;實驗用一級水 均產自Milli-Q超純水系統;大白兔奶糖、雀巢軟糖、阿爾卑斯硬糖、徐福記軟糖樣品 購自零售超市和商店,生產廠家分別為上海冠生園食品有限公司、雀巢集團、不凡帝范梅勒集團公司、徐記食品有限公司。

TSQ QUANTUM ACCESS高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜(配電噴霧離子源和自動進樣器) 美國Thermo Scientific公司;XW-80A旋渦混合器 上海醫大儀器廠;H-2050R高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;十萬分之一電子天平 瑞士梅特勒公司;Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司;BS305A-200料理機 中國蘇泊爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜及質譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm,5.0 μm)。流動相:A相為甲醇,B相為0.1%甲酸水,C相為乙腈;梯度洗脫程序見表1;流速:0.2 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of liquid phase

質譜條件:電噴霧離子源,負離子模式(ESI-);毛細管電壓:3000 V;霧化氣:207 kPa;輔助氣:55 kPa;碰撞氣:10 kPa;毛細管溫度:360 ℃;選擇反應監測掃描(SRM)。反應監測實驗條件見表2。

表2 2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的質譜反應監測條件Table 2 Mass spectroscopic conditions for 2-(4-methoxyphenoxy)-propionic acid

1.2.2 樣品前處理 取糖果樣品500.0 g,粉碎后充分混勻,裝入潔凈容器中,密封,于0～4 ℃保存。稱取上述糖果樣品1.0 g,于10.0 mL離心管中,加入3.0 mL pH8.0的水溶液和2.0 mL乙腈,渦旋混合均勻。再加入5.0 mL正己烷混合均勻,4000 r/min(10 ℃)離心10 min。去除正己烷層,取下層的水相直接過水相膜(0.22 μm)。一般來說,甜味抑制劑的使用量為樣品質量的萬分之一到萬分之二,所以過膜后的液體需稀釋50～200倍后,供HPLC-MS/MS測定[14-15]。

1.2.3 色譜條件和樣品前處理條件的優化

1.2.2.1 色譜柱的選擇 為了能使目標化合物有一個較好的分離效果,本實驗對比了Agilent ZORBAXSB-C18(150 mm×2.1 m,5.0 μm)色譜柱、Eclipse Plus C8(150 mm×2.1 m,3.5 μm)色譜柱和ZIC-HILIC(150 mm×2.1 mm,5.0 μm)色譜柱的分離效果。流動相:I相為甲醇,Ⅱ相為0.1%甲酸水,Ⅲ相為乙腈(35∶5∶60,V/V/V)。

1.2.2.2 流動相的選擇 液相色譜的流動相比較了A. 甲醇-0.1%甲酸水-乙腈、B. 甲醇-0.1%甲酸水、C. 甲醇-10.0 mmol/L乙酸銨-乙腈溶液三種組成進行梯度洗脫,通過峰形、保留時間等因素確定最佳流動相組成。三種流動相梯度洗脫程序分別為:A. 0～2.0 min,0%Ⅰ,95%Ⅱ;2.1～6.5 min,10%Ⅰ,5%Ⅱ;6.6～9.0 min,55%Ⅰ,5%Ⅱ;9.1～12.0 min,%Ⅰ,95%Ⅱ;B. 0～2.0 min,5%Ⅰ;2.1～9.0 min,95%Ⅰ;9.1～10.0 min,5%Ⅰ;C. 0～2.0 min,0%Ⅰ,95%Ⅱ;2.1～6.5 min,10%Ⅰ,5%Ⅱ;6.6～9.0 min,55%Ⅰ,5%Ⅱ;9.1～11.0 min,0%Ⅰ,95%Ⅱ。在上述條件下,色譜柱為Agilent ZORBAXSB-C18。

1.2.2.3 提取溶劑的選擇 本研究在其他前處理條件不變的情況下,添加水平為20 μg/kg,提取溶劑分別選擇:超純水(pH7.0)、水溶液(pH8.0)∶乙腈=1∶1 (V/V)、水溶液(pH8.0)∶乙腈=1.5∶1 (V/V)、水溶液(pH8.0)∶乙腈=2∶1、水溶液(pH8.0)∶乙腈=3∶1 (V/V),通過回收率進行比較,確定最佳的提取溶劑。

1.2.4 標準曲線的繪制 稱取10.0 mg 2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸標準品于燒杯中,加入甲醇充分溶解并轉移到100.0 mL容量瓶中,定容,配制成100.0 mg/L標準儲備液,4 ℃冷藏保存。吸取1.0 mL標準儲備液于100.0 mL容量瓶中,用甲醇定容至100.0 mL,得1.0 mg/L的標準工作溶液,4 ℃保存。將標準工作溶液用甲醇稀釋成6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/L系列標準工作溶液,現配現用。以定量離子峰面積為縱坐標,相應的濃度為橫坐標(μg/L)做標準曲線。按3倍空白信噪比(S/N)含量為方法檢出限(LOD),10倍空白信噪比(S/N)含量為方法定量限(LOQ),計算方法檢出限和定量限。

1.2.5 添加回收率、精密度實驗 稱取糖果陰性樣品1.0 g,添加當量為20.0、40.0和200.0 μg/kg的標準溶液,按1.2.2樣品處理,進行3個獨立加標試樣檢測,每個獨立加標試樣6個平行樣,計算回收率和相對標準偏差。

1.2.6 穩定性實驗 穩定性實驗由化合物的日內和日間測定結果的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)來驗證。配制濃度為20.0 μg/L的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸標準品溶液,一日內重復進樣6次,連續6 d,分別計算日內和日間RSD值。

1.3 數據處理

數據處理采用Analyst及MultiQuantTM軟件進行分析,其他數據采用Origin 8.0作圖。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

依據歐盟2002/657/EC,液相分離與物質二級質譜可作為HPLC-MS/MS鑒定物質的依據。因此,在掃描并采集2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸質譜數據時,采用SRM模式,通過ESI源可獲得待測化合物的準分子離子。

2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的分子結構中含有羧基,在檢測時容易失去質子,產生豐度較高的[M-H]-,因此選用ESI負離子模式進行檢測。通過一級質譜分析,得到母離子分子離子峰[M-H]-。然后,進行二級質譜分析,從打碎的離子碎片中選2個特征離子碎片作為定性與定量離子,選擇其中m/z較高的108.2作為定量離子,通過優化錐孔電壓、碰撞能量,使特征離子強度響應最大。優化后的質譜條件見表2。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇 在使用Eclipse Plus C8(150 mm×2.1 m,3.5 μm)色譜柱和ZIC-HILIC(150 mm×2.1 mm,5.0 μm)色譜柱時,目標化合物出峰時間較長,且色譜峰拖尾嚴重,峰寬較寬(圖1B～圖1C),而使用Agilent ZORBAXSB-C18(150 mm×2.1 m,5.0 μm)色譜柱時,目標化合物有很好的保留,峰對稱性好,窄且尖銳(圖1A)。因此,本文選用了Agilent ZORBAXSB-C18色譜柱進行樣品分離分析。

圖1 不同色譜柱條件下,2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸標準品的SRM色譜圖

2.2.2 流動相的選擇 流動相的水相對比了10.0 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸水,有機相對比了甲醇和乙腈。結果表明,當有機相為甲醇時,洗脫柱壓較大,且目標色譜峰出峰時間較早,加入乙腈后,發現目標化合物出峰時間后移。通過調節甲醇與乙腈的體積比,可使出峰時間適中,見圖2A～圖2B。當水相為10.0 mmol/L乙酸銨時,發現2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的離子化效率會有所提高,但其色譜峰型較差,拖尾嚴重(圖2 C);當采用0.1%甲酸水時,可使提取液中的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉轉變成2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸,并且色譜峰峰形尖銳、對稱性好,雖然其離子化效率會被輕微抑制,但其靈敏度也可以滿足檢測要求。因此,本實驗采用Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 m,5.0 μm)為分離柱,甲醇-0.1%甲酸水-乙腈三相混合為流動相進行梯度洗脫。

圖2 不同流動相條件下,2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸標準品的SRM色譜圖

2.3 提取溶劑的選擇

2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉是強堿弱酸鹽,在中性和堿性條件下水溶性較好。采用上述五種提取溶劑,重復5次,結果見表3。弱堿性條件下回收率高于純水的回收率,這是因為在弱堿性條件下,目標化合物解離較充分,易于提取。但是,弱堿性條件下同時也會提取出大量水溶性蛋白等雜質,從而影響提取效率。因此,需加入一定量的乙腈使蛋白變性,除去蛋白。表3為不同提取溶劑的回收率結果。由表3可知,當水溶液(pH8.0)∶乙腈=1.5∶1、2∶1和3∶1時,回收率均大于80%。為了使蛋白除去更徹底,同時保護三重四極桿質譜儀,最后選擇水溶液(pH8.0)∶乙腈=1.5∶1 (V/V)作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑下2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉的平均回收率Table 3 The average recoveries of the sodium 2-(4-methoxyphenoxy)-propanoate under different extraction solvents

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 采用1.2.4節中制備的系列標準工作溶液,按優化后的儀器條件檢測,得到2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸線性方程Y=534969.9+12516.2X及相關系數r=0.9998。由表4可見,2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸檢出限和定量限分別為8.0、20.0 μg/kg,并在6.25～100.00 μg/L濃度范圍內線性良好。

表4 2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的線性方程、相關系數及方法檢出限和定量限Table 4 Linear equation,correlation coefficient(r),limit of detection and limit of quantitation of 2-(4-methoxyphenoxy)-propionic acid

2.4.2 回收率和精密度 回收率和精密度結果見表5。從表5可以看出,三個加標水平回收率分別為82.7%、83.8%和90.7%,均大于80%,RSD值為2.5%～4.2%,均小于5%,說明該方法有較好的回收率和精密度。

表5 加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 5 Recovery and relative standard deviation(n=6)

2.5 穩定性試驗

穩定性實驗由化合物的日內和日間測定結果的RSD來驗證。結果表明,2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸標準品的日內測定含量的RSD為1.3%,日間測定含量的RSD為1.8%,RSD值均小于2.0%,說明該方法具有很好的穩定性。

2.6 實際樣品分析

按上述實驗方法對市面上的4種糖果(大白兔奶糖、雀巢軟糖、阿爾卑斯硬糖、徐福記軟糖)共20批次進行2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉含量檢測。實驗結果表明,所有測試樣中均未檢測出2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉。

3 結論

本研究建立了糖果中降甜劑2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉的HPLC-MS/MS的定性、定量檢測方法。樣品采用水溶液(pH8.0)∶乙腈=1.5∶1 (V/V)作為提取溶劑。液相色譜采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱,甲醇-0.1%甲酸-乙腈水溶液作流動相進行梯度洗脫。質譜分析采用電噴霧多反應監測模式,外標法定量。該方法在6.25～100.00 μg/L范圍內線性關系良好(相關系數r=0.9998),檢出限為8.0 μg/kg,定量限為20.0 μg/kg。回收率為82.7%～90.7%,相對標準偏差為2.5%～4.2%。穩定性實驗RSD值均小于2.0%。本方法簡單快捷,峰形尖銳對稱,靈敏度及回收率高、重現性好,為糖果中2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸鈉的檢測提供了一種新的手段。