復合酶協(xié)同水解法制備綠豆抗氧化多肽

馬詩文,高 云,*,韓思楊,湯 梅,陳 如,李彤彤,方志剛,陸永禎

(1.遼寧科技大學化學工程學院,遼寧鞍山 114051;2.遼寧科技大學創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)中心,遼寧鞍山 114051)

綠豆又稱青小豆,是豆科豇豆屬一年生草本植物綠豆的成熟種子,具有解毒消腫、消暑利尿和抗氧化作用[1]。綠豆多肽是綠豆分離蛋白經(jīng)水解而成的低聚肽混合物,由于相對分子質(zhì)量較小,具有水溶性高、黏度低、穩(wěn)定性強等特性[2-3],人體極易吸收,可提高機體免疫力[4-5],降低膽固醇、改善腎功能[6],還具有很強的抗氧化性,可作為新型抗氧化劑使用[7-8]。我國綠豆資源豐富,價格低廉,目前綠豆產(chǎn)品的深加工主要集中在綠豆淀粉的利用和生理活性物質(zhì)提取等方面[9-10],生產(chǎn)中的綠豆蛋白等副產(chǎn)物含量高,營養(yǎng)價值豐富,尚未得到充分利用,制備綠豆多肽是綠豆蛋白綜合利用的有效途徑。

優(yōu)化綠豆蛋白的水解條件是改進制備綠豆多肽的重要方法,蛋白酶的選擇及其酶解條件對綠豆多肽的制備以及抗氧化活性有著重要的影響[11-12]。目前,國內(nèi)對綠豆多肽的研究多集中在單酶水解的研究。盧珍華等[13]通過研究木瓜蛋白酶對綠豆蛋白的水解作用,確定最佳反應條件為:酶濃度8%,底物濃度9%,反應溫度65 ℃,反應時間3 h,pH6.5。傅亮等[14]以堿性蛋白酶酶解制備綠豆多肽,得到最佳酶解條件下的水解度為23.09%。顧薇等[15]利用中性蛋白酶對綠豆分離蛋白進行酶法水解以制備寡肽,水解度的平均值可達28.82%。但是以復合酶協(xié)同水解綠豆蛋白制備綠豆多肽的研究尚未見報道。

本研究以綠豆蛋白為原料,以水解度為控制指標,選取堿性蛋白酶及中性蛋白酶復合,提供復合酶協(xié)同水解制備綠豆抗氧化肽的最佳工藝條件,為制備綠豆多肽提供了新思路。通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化綠豆蛋白酶解的最適條件,并對綠豆抗氧化肽的自由基清除能力進行研究,為綠豆產(chǎn)品的深加工及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆蛋白 哈爾濱哈達淀粉有限公司;中性蛋白酶(酶活力50000 U/g)、堿性蛋白酶(酶活力200000 U/g) 安琪酵母股份有限公司;DPPH Sigma公司;氫氧化鈉、甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、Tris-HCl緩沖溶液、鄰苯三酚、VC國藥化學試劑有限公司。

FA2004N型電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司;DF-101型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 北京世紀森朗實驗儀器有限公司;PHSJ-5型實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;DT5-1型低速離心機 北京時代北利離心機有限公司;722S型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆抗氧化多肽制備工藝流程 配制一定濃度的綠豆分離蛋白水溶液,控制溫度值為85 ℃水浴保溫15 min。達到反應溫度值后,調(diào)節(jié)pH至適當值,冷卻到酶適宜溫度保溫。加入水解所需的蛋白酶,將得到的水解液放入水浴鍋中進行恒溫酶解反應。反應適當時間取出置于沸水浴中加熱15 min以滅酶。將滅酶后的酶解液冷卻至40 ℃,于離心機中以4000 r/min離心分離15 min,取出上清液待用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 pH對酶解效果的影響 在底物濃度為8%、酶解溫度為54 ℃、酶用量為4%等條件相同的情況下,調(diào)節(jié)pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復合對綠豆蛋白進行水解,水解3 h,以水解度為指標,考察pH對酶解效果的影響。

1.2.2.2 溫度對酶解效果的影響 在底物濃度為8%、pH為8.0、酶用量為4%等條件相同的情況下,分別在酶解溫度為46、48、50、52、54、56、58 ℃時,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復合對綠豆蛋白溶液進行水解,水解時間為3 h,以水解度為指標,考察酶解溫度對酶解效果的影響。

1.2.2.3 底物濃度對酶解效果的影響 在pH為8.0、酶解溫度為54 ℃、酶用量為4%等條件相同的情況下,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復合對綠豆蛋白溶液進行水解,分別改變底物濃度為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,水解時間為3 h,以水解度為指標,考察底物濃度對酶解效果的影響。

行間清耕、間作小麥、自然生草3個處理按照順序分別選定10株蘋果幼樹；測定2015年蘋果幼樹的定干高度、生長量；2016年測定蘋果幼樹生長狀況；測定蘋果幼樹中心干和分枝中部的20片葉片長寬、葉柄長粗及葉綠素含量等，用數(shù)顯游標卡尺測定葉片長寬和葉柄長粗；用TYS-A型葉綠素測定儀測定葉片葉綠素含量，每個葉片測4個部位。在行間清耕、間作小麥、自然生草3個處理分別選6行樹，每行選一個灌溉帶，調(diào)查蘋果幼樹成花株數(shù)和每株成花樹的成花數(shù)。

1.2.2.4 酶用量對酶解效果的影響 在底物濃度為8%、pH為8.0、溫度為54 ℃等條件相同的情況下,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復合對綠豆蛋白溶液進行水解,分別改變酶用量為2%、3%、4%、5%、6%、7%,水解時間為3 h,以水解度為指標,考察酶用量對酶解效果的影響。

1.2.3 復合酶加酶方式實驗 復合酶協(xié)同水解實驗選取催化作用效果好的中性蛋白酶及堿性蛋白酶兩種酶作為復合酶組合,按照以下水解步驟進行:先將其中一種蛋白酶加入綠豆蛋白溶液中,考慮反應結(jié)束后是否進行滅酶,再加入第二種蛋白酶,水解一定時間后終止反應,實驗設計見表1。

表1 復合酶加入方式對水解度的影響Table 1 Effect of composite enzyme addition method on hydrolysis degree

1.2.4 正交試驗設計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以pH、酶解溫度、底物濃度、酶用量為影響因素,以水解度為指標,對復合水解綠豆蛋白制備綠豆多肽進行L9(34)正交實驗進行優(yōu)化,把單因素實驗中得出的最佳條件確定為各因素的中間水平,實驗因素及水平見表2。

表2 L9(34)正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 水解度的測定 水解度的測定采用甲醛滴定法[16]。取適量綠豆蛋白水解液,加入60 mL去CO2蒸餾水,用精密pH計調(diào)節(jié)pH為8.20,加入20 mL已中和pH為8.20的甲醛,然后用0.1000 mol/L標準NaOH溶液滴定pH到9.20,記下消耗NaOH的體積V1,用蒸餾水替代樣品,同時做空白實驗,記錄空白實驗消耗NaOH的體積V0,并用以下公式計算蛋白質(zhì)的水解度。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定 取200 μL綠豆多肽溶液加入到5 mL 0.05 mmol/L DPPH無水乙醇溶液中,用無水乙醇定容到6 mL,搖勻,在室溫下避光反應20 min,用無水乙醇做參比在517 nm處測定吸光度A0。用無水乙醇代替5 mL DPPH溶液,測定得到的吸光度為A1,并用以下公式表示樣品對DPPH清除率[17]。

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定[18]。取200 μL綠豆多肽溶液,加入到5.76 mL、pH8.2的50 mmol/L Tris-HCL緩沖溶液中,振蕩混勻,在25 ℃水浴保溫10 min后加入40 μL、25 mmol/L鄰苯三酚(25 ℃水浴預熱處理),迅速混合開始計時。測定5 min內(nèi)在320 nm處的吸光度,每隔30 s讀數(shù)一次。以蒸餾水代替樣品溶液作為對照,分別將樣品管和對照管作吸光度隨時間變化得回歸方程,其斜率為自氧化速率。記樣品管自氧化速率為ΔA0,對照管自氧化速率為ΔA1,用以下公式表示樣品對超氧陰離子清除率。

1.2.8 羥自由基清除率的測定 采用水楊酸法測定[14]。取200 μL綠豆多肽溶液,加入到5 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液和5 mL、6 mmol/L雙氧水溶液混合溶液中,搖勻后加入2 mL、6 mmol/L水楊酸溶液,混合后立即在510 nm測A0值。用蒸餾水代替樣品溶液作為對照,測定得到的吸光度為A1。用以下公式表示樣品對羥自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復三次,實驗結(jié)果分析取平均值±標準差。采用Origin Pro 8.5進行作圖、正交試驗設計助手(II3.1)軟件進行正交試驗設計。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 pH對酶解反應的影響 酶的空間構型在酸堿不適宜的情況下會產(chǎn)生變化,從而導致酶失活;此外,pH會影響底物與酶的解離狀態(tài),影響蛋白質(zhì)的水解程度。圖1表明,復合酶協(xié)同水解綠豆蛋白的反應中,水解度的值會隨著pH的變化而變化。水解反應在pH6.5～8.5的范圍之間時,水解度測定結(jié)果會隨pH的增加而上升。在pH為8.5時綠豆分離蛋白水解度最高,水解效果最好。當pH超過8.5時,水解度開始緩慢下降。說明pH為8.5時復合酶的酶活最強,水解效果最好。

圖1 pH對水解度的影響

2.1.2 溫度對酶解反應的影響 酶促反應中溫度過高會對蛋白酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,易致酶失活,其次酶促反應過程中,溫度會分別影響酶與底物、酶與抑制劑、激活劑、輔酶的結(jié)合。由圖2可知,不同溫度條件下,反應水解度值表現(xiàn)不同。隨著溫度的上升水解度也在不斷升高,溫度控制為54 ℃的時候,水解綠豆蛋白得到的水解度較高,達到峰值,說明此時水解效果最好。而溫度超過54 ℃時,水解度開始呈緩慢下降趨勢,這可能是高溫影響了酶本身的活性而影響了產(chǎn)物的水解度。

圖2 溫度對水解度的影響

2.1.3 底物濃度對酶解反應的影響 酶解反應中,底物濃度過高會增大水解液黏度從而產(chǎn)生底物抑制作用;此外,隨著反應底物減少,酶量過剩會導致水解反應變慢。圖3表明,隨著底物濃度的增加,水解度也呈快速上升趨勢,在底物濃度為10%時水解度達到最大,當?shù)孜餄舛葹?%時趨于平衡。綜合考慮底物濃度對底物的抑制作用,認為復合酶水解綠豆蛋白在底物濃度為9%的時候,水解度較高,說明此時水解效果好,其次底物濃度為10%、8%、7%、6%、5%、4%。

圖3 底物濃度對水解度的影響

2.1.4 酶用量對酶解反應的影響 酶用量即為標注活力/底物量,酶用量對酶與底物反應具有促進作用。圖4表明,加入不同酶用量酶解綠豆蛋白溶液,水解度值也有所不同。由圖4中上升趨勢可知,酶用量數(shù)值越高水解度也在增加。根據(jù)上述的實驗結(jié)果以及實驗材料的經(jīng)濟性原則,認為選擇酶用量3%、4%、5%進行正交試驗。

圖4 酶用量對水解度的影響

2.2 堿性蛋白酶和中性蛋白酶復合酶解水解條件的優(yōu)化

2.2.1 復合酶加入方式對酶解水解度的影響 通過堿性蛋白酶和中性蛋白酶加酶順序的差異以及加酶過程中是否進行滅酶,將復合酶兩者比例設置為1∶1,研究復合酶加入方式對綠豆蛋白水解度的影響,復合酶加入方式對水解度的影響結(jié)果如表3所示。

表3 復合酶加入方式對水解度的影響Table 3 Effect of composite enzyme addition method on hydrolysis degree

由表3中數(shù)據(jù)可知實驗序號4的實驗結(jié)果最高,即堿性蛋白酶和中性蛋白酶復合酶協(xié)同水解的最佳加酶方式為先加入堿性蛋白酶,中間不需要經(jīng)過高溫滅酶處理,再加入中性蛋白酶酶解,這種加酶方式所得的酶解物水解度最高,水解度可達到30.89%。

2.2.2 正交實驗設計及結(jié)果 在上述的堿性蛋白酶和中性蛋白酶復合酶法最佳加酶方式的條件下,對復合酶水解綠豆蛋白的最佳工藝條件進行優(yōu)化。選取A(pH)、B(溫度)、C(底物濃度)、D(酶用量)為4個因素,各取3個水平,以水解度為指標進行正交實驗,實驗結(jié)果如表4和表5所示。

表4 正交實驗結(jié)果與分析Table 4 Results of analysis orthogonal experiment

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Result of variance analysis

由正交試驗結(jié)果可知:各個因素對雙酶協(xié)同水解反應的水解度大小影響程度的主次關系為:A>D>B>C,即pH>酶用量>酶解溫度>底物濃度,復合酶協(xié)同水解綠豆蛋白的最佳工藝條件是A3B3C1D2,即pH為8.5、溫度56 ℃、底物濃度為8%、酶用量4%,根據(jù)此最佳工藝條件進行3次重復驗證實驗操作,實際測得的水解度平均值為33.95%,超過了此前各組酶解工藝水解度值。

2.3 綠豆抗氧化肽的抗氧化活性評價

抗氧化活性評價主要測定單酶水解物(為中性蛋白酶單酶水解綠豆蛋白的水解物)、復合酶水解物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除率,探討綠豆多肽在3種抗氧化體系中的抗氧化作用,并以VC和綠豆蛋白作為對照。

2.3.1 綠豆抗氧化肽清除DPPH自由基能力 由圖5可知,各個樣品都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除活性,且活性均隨樣品濃度水平的提高而顯著上升。在樣品質(zhì)量濃度達到0.4 mg/mL時,復合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物DPPH自由基的清除率達到82.8%;對于單酶水解綠豆蛋白而言,清除能力最大為79.18%。而在相同濃度下,陽性對照VC的最大清除率為89.5%,綠豆蛋白的最大清除率為56.13%。這說明在相同濃度下VC清除DPPH·的能力表現(xiàn)最好,其次為復合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物,單酶水解綠豆蛋白的水解物低于復合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物而高于綠豆蛋白。

圖5 綠豆多肽對DPPH·清除能力的影響

圖6 綠豆多肽對清除能力的影響

2.3.3 綠豆抗氧化肽清除羥自由基能力 由圖7可知,各個樣品對OH·均具有較好的清除能力,且清除能力均隨樣品濃度水平的提高而提高。在樣品質(zhì)量濃度達到20 mg/mL時,四種樣品對OH自由基的清除率趨于平穩(wěn);陽性對照VC的清除能力最大為69.51%,復合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物最大值為56.85%,單酶水解綠豆蛋白清除能力最大為50.24%,綠豆蛋白的最大清除率為41.62%。這說明在相同濃度下復合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物優(yōu)于單酶水解綠豆蛋白的水解物清除OH·的能力。兩者均低于VC,而高于綠豆蛋白。

圖7 綠豆多肽對OH·清除能力的影響

3 結(jié)論

本實驗通過復合酶協(xié)同水解法制備綠豆抗氧化活性多肽,并對綠豆多肽的抗氧化活性進行評價。通過單因素實驗結(jié)合正交實驗得到復合酶協(xié)同水解綠豆蛋白的最適反應條件為pH8.5,溫度56 ℃,底物濃度8%,酶用量4%,水解度可以達到33.95%。同時發(fā)現(xiàn)綠豆抗氧化多肽對DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥自由基均有良好的清除能力,復合酶協(xié)同水解得到的綠豆抗氧化多肽對DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥自由基清除率分別為82.8%,76.82%和56.85%,表明綠豆多肽抗氧化效果明顯,在保健食品領域有一定的開發(fā)利用價值。