益生菌山藥飲料發酵工藝優化及其冷藏穩定性

黃 天,韓之皓,郭 帥,鄭 巖,王月嬌,白 梅,王記成,孫天松

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業部奶制品加工重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

山藥又稱薯蕷,為薯蕷蔓性植物的塊莖[1],其性甘、平、無毒,常食之可強健身體,有助于消化[2]。 山藥中含淀粉、人體必需的蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素和皂甙黏液質等營養成分[3]。

作為傳統的藥食同源食品,對山藥的加工利用一直是人們研究的重點[4]。山藥經糖化酶糖化后接種益生菌發酵可加工成具有益生作用的發酵食品。益生菌發酵作用既提高了制品的營養價值為制品增加了益生特性,又改善了產品的風味、口感[5]。研究開發益生菌發酵山藥飲料,不僅增加了國內乳酸菌飲品種類,也為山藥綜合開發利用提供了新的途徑。

近年來山藥發酵飲料在國內的研究開發上,大部分都集中在復合型山藥發酵飲料、山藥發酵乳以及山藥發酵醋的應用上[6-8]。盧霖等[9]以薏米、山藥為主要原料,通過對發酵工藝條件進行研究,制備出口感柔和細膩、滑潤爽口、米香豆香純正的薏米山藥乳酸飲料;高晗等[10]對山藥發酵乳工藝配方進行優化,制備出口感細膩、組織均勻且凝固性好,富有濃郁的山藥香氣的山藥發酵乳。國外對山藥的研究主要集中在有效成分上,發酵飲料相關文獻鮮有[11]。

本研究以山藥粉為原料,以益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9為發酵劑發酵山藥飲料,將益生菌與山藥結合,開發一種兼具山藥的營養價值及益生菌益生功能的益生菌山藥飲料。目前國內市場還未有以山藥為原料制成的發酵型活菌飲料,因此具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用L.plantarumP-8和B.lactisV9直投式發酵劑 均由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種庫提供;山藥粉 購自河南省焦作縣;耐高溫a-淀粉酶(酶活18萬U/g)、糖化酶(酶活26U/g) 購自滄州夏盛酶生物技術有限公司。

HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;vortex-genie2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司;HA-300M全自動高壓蒸汽滅菌器 日本HIRAYAMA公司;pHS-3C 型pH計 上海雷磁儀器廠;LRH-250生化培養箱 上海一恒科技有限公司;SRH高壓均質機 上海申鹿均質機有限公司;SJ-CJ-2FDQ超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 益生菌山藥飲料制作流程 將山藥粉和水按1∶7料水比混合均勻,在25 MPa下均質后升溫至90 ℃添加耐高溫a-淀粉酶(酶添加量0.2%,酶解pH6.5)進行液化工藝,酶解60 min后冷卻至60 ℃添加糖化酶(酶添加量0.2%,酶解pH4.4)進行糖化工藝,以碘比色法判斷山藥淀粉水解是否完全[12]。酶解完全后升溫至95 ℃,進行95 ℃ 300 s滅酶后冷卻至37 ℃(得到酶解山藥漿)進行接菌(接種量2×106CFU/mL),恒溫發酵18 h后終止發酵并進行調配,在25 MPa下均質后進行罐裝,最終得到益生菌山藥飲料成品。

1.2.2 益生菌山藥飲料發酵條件單因素實驗

1.2.2.1 發酵時間的確定 將益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復配,以2×106CFU/mL接種量接種至酶解山藥漿中,37 ℃分別發酵0、3、6、9、12、15、18、21、24 h,以活菌數、滴定酸度和pH為評價指標,確定合適的發酵時間。

1.2.2.2 接種量的確定 將益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復配,分別按1×106、2×106、3×106、4×106、5×106CFU/mL的接種量接種至酶解山藥漿中37 ℃發酵至1.2.2.1確定的發酵時間,以活菌數、滴定酸度和pH為評價指標,確定合適的接種量。

1.2.2.3 發酵溫度的確定 將益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復配,以1.2.2.2節確定的接種量接種至酶解山藥漿中,分別在33、35、37、39、41 ℃下發酵至1.2.2.1確定的發酵時間,以活菌數、滴定酸度和pH為評價指標,確定合適的發酵溫度。

1.2.3 益生菌山藥飲料發酵條件響應曲面法優化試驗 根據響應面軟件Design-Expert 8.0.6 Trial中Response surface選項卡下Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,在單因素實驗的基礎上,采用3因素3水平的響應曲面分析方法。pH是指溶液中氫離子的總數和總物質的量的比,滴定酸度是指溶液中能與強堿發生中和作用的物質的總量。因此滴定酸度比pH更能代表發酵過程中酸度的變化,故確定酶解山藥漿活菌數和滴定酸度為響應值,以接種量、發酵時間、發酵溫度為自變量,分別以A、B、C表示,并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。試驗因素水平及編碼見表2。

表2 響應面優化試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface expcriment

1.3 益生菌山藥飲料貯藏試驗

將發酵后酶解山藥漿進行調配、均質后得到益生菌山藥飲料成品,對其進行貯藏試驗。樣品于4 ℃下貯藏28 d,每隔7 d取樣,測定樣品的pH、滴定酸度和活菌數,并對樣品進行感官評定。

1.4 指標測定

1.4.1 pH的測定 采用雷磁 pH S-3C型pH計測定。

1.4.2 滴定酸度的測定 益生菌山藥飲料的滴定酸度按照國家標準GB 5009-239-2016中規定的“酚酞指示劑法”進行檢測[13]。

1.4.3 活菌數的測定 將益生菌山藥飲料取樣進行梯度稀釋,采用MRS培養基傾注培養測定活菌數[14]。

1.5 發酵山藥飲料樣品感官評定

貯藏期間,每隔14 d對益生菌山藥飲料貯藏樣品進行一次感官評定。感官評定小組由10名評定人員組成,10名評定人員經常飲用活性乳酸菌飲料且全部為食品專業學生,并接受兩次兩小時的評鑒培訓[15]。評分采用100分制[16],具體感官評定標準見表3。

表3 飲料感官評定方案Table 3 Evaluate method of sensory of beverage

1.6 數據處理

每組實驗重復3 次,數據均以平均值表示。實驗圖表采用Origin Pro繪制,響應面試驗設計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 益生菌山藥飲料發酵條件單因素實驗

2.1.1 發酵時間的確定 酶解山藥漿在發酵過程中活菌數、滴定酸度和pH隨時間變化測定結果如圖1所示。

圖1 發酵時間對酶解山藥漿活菌數、滴定酸度和pH的影響

由圖1可知,在接種量和發酵溫度一定的情況下,酶解山藥漿活菌數隨發酵時間延長呈不斷上升趨勢。當發酵時間達18 h后,隨發酵時間的延長活菌數變化不顯著,說明18 h后益生菌生長已經處于穩定狀態。

隨發酵時間的延長,酶解山藥漿pH不斷下降,滴定酸度不斷上升。這是由于在發酵過程中,益生菌不斷利用發酵基質中的糖類產酸,使乳酸累積,酸度上升[17]。當發酵時間達18 h后,隨發酵時間延長滴定酸度略有增加,基本呈平緩趨勢;pH隨發酵時間的延長無顯著變化,此時pH達到3.85左右,與唐維媛等[18]的研究結果有相似之處。

益生菌發酵產酸量及發酵的完全程度會受到發酵時間的直接影響。發酵時間過長,產酸量大,酸度過低;發酵時間過短,發酵進行不完全[19]。復合益生菌發酵不僅可提高活菌數,還可對產品的酸度和風味等產生積極影響。綜合發酵時間對活菌數、滴定酸度及pH的影響結果,確定適宜的發酵時間約為18 h。

2.1.2 接種量的確定 酶解山藥漿在不同接種量下37 ℃恒溫發酵18 h后活菌數和酸度測定結果如圖2所示。

圖2 接種量對酶解山藥漿活菌數、滴定酸度和pH的影響

由圖2可知,在發酵溫度和發酵時間相同的情況下,不同接種量的酶解山藥漿在發酵終止時活菌數隨接種量增大呈逐漸上升的變化趨勢。當接種量高于2×106CFU/mL后,隨接種量增大活菌數上升趨勢無顯著變化。說明當接種量為2×106CFU/mL時,此時底物濃度與益生菌的比例接近最佳,增加接種量對活菌數增長沒有明顯變化。

發酵終止時酶解山藥漿pH隨接種量增大呈逐漸下降的變化趨勢。當接種量高于2×106CFU/mL后,pH下降趨勢不顯著。

發酵終止時酶解山藥漿滴定酸度隨接種量增大呈逐漸上升的變化趨勢。當接種量高于2×106CFU/mL后,滴定酸度上升趨勢隨接種量增大變化不顯著,與發酵終止時活菌數的增長趨勢相符合。

發酵劑接種量不僅對酶解山藥漿活菌數和酸度產生直接影響,對發酵結束后飲料的口感及風味也起到決定性作用。接種量過小,產酸速率慢,發酵時間延長;接種量過大,產酸速率快,發酵前期酸度上升過快導致發酵后飲料風味變差[20]。綜合接種量對活菌數、滴定酸度及pH的影響結果,確定L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復配發酵酶解山藥漿的適宜接種量約為2×106CFU/mL。

2.1.3 發酵溫度的確定 不同溫度下分別恒溫發酵18 h后酶解山藥漿活菌數和酸度測定結果如圖3所示。

圖3 發酵溫度對酶解山藥漿活菌數、滴定酸度和pH的影響

由圖3可知,在接種量和發酵時間相同的情況下,不同發酵溫度下的酶解山藥漿在發酵終止時活菌數隨發酵溫度升高呈先增大后減小的變化趨勢。發酵溫度過低或過高均會抑制益生菌的生長,導致產品活菌數下降,從而影響產酸能力[21]。當發酵溫度為33 ℃時,由于發酵溫度較低,導致代謝不活躍,影響活菌數的增長;當發酵溫度為41 ℃時,可能是由于發酵溫度較高,菌體生長較慢,導致活菌數下降。

酶解山藥漿pH隨發酵溫度升高呈先下降后上升的變化趨勢,滴定酸度隨發酵溫度升高呈先上升后下降的變化趨勢。pH和滴定酸度變化與活菌數變化相符合。益生菌生長會受到發酵溫度的影響,進而影響發酵的速度及發酵過程中乳酸的積累[22]。綜合發酵溫度對活菌數、滴定酸度及pH的影響,確定適宜發酵溫度約為37 ℃。

2.2 益生菌山藥飲料發酵條件響應曲面法優化試驗

響應面法優化發酵益生菌山藥飲料生產工藝的試驗結果如表4所示。

表4 響應面優化試驗結果Table 4 Results of response surface optimization test

通過Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對試驗數據進行多元回歸擬合,分別得到滴定酸度和活菌數對接種量(A)、發酵時間(B)、發酵溫度(C)的二次多元回歸方程為:

Y1=107.36+0.97A+3.00B-0.98C-1.16AB-1.45AC-1.16BC-7.94A2-6.84B2-0.46C2

Y2=8.65-0.005A+0.088B+0.012C+AB+0.025AC-0.060BC-0.097A2-0.12B2-0.16C2

對滴定酸度和活菌數兩個模型進行方差分析,結果見表5。

表5 回歸模型系數顯著性檢驗Table 5 Regression model coefficient significance test

根據回歸方程,作響應面圖及等高線圖,結果見圖4～圖6。

圖4 接種量和發酵溫度對滴定酸度影響的響應面圖及等高線圖

圖5 發酵時間和發酵溫度對滴定酸度影響的響應面圖及等高線圖

圖6 發酵時間和發酵溫度對活菌數影響的響應面圖及等高線圖

圖4顯示,隨接種量增加,滴定酸度呈先增大后減小的趨勢,接種量和發酵溫度對滴定酸度影響的響應面坡度比較陡峭,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說明接種量和發酵溫度之間的交互作用對滴定酸度的影響顯著。

圖5顯示,隨發酵時間延長,滴定酸度呈先增大后減小的趨勢,發酵時間和發酵溫度對滴定酸度影響的響應面坡度比較陡峭,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說明發酵時間和發酵溫度之間的交互作用。

圖6顯示活菌數隨發酵溫度升高和發酵時間延長,呈先增大后減小的趨勢。發酵溫度和發酵活菌數的影響響應面坡度陡峭程度明顯,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說明發酵溫度和發酵時間之間的交互作用對活菌數的影響顯著,此表現與模型得出p值一致。

通過上述回歸模型,采用響應面分析優化后獲得益生菌山藥飲料最佳發酵工藝條件為:2.02×106CFU/mL、發酵時間為19.10 h、發酵溫度為36.96 ℃。在該工藝條件下,益生菌山藥飲料活菌數理論值可達8.66lg CFU/mL,滴定酸度理論值可達107.53 °T。考慮到實際生產操作,將最佳工藝參數調整為:接種量2×106CFU/mL、發酵時間19.1 h、發酵溫度37 ℃。在調整過后所得最佳發酵工藝條件下對其進行驗證試驗,試驗重復三次并取平均值,得出結果測得益生菌山藥飲料的實際活菌數為4.3×108CFU/mL,滴定酸度為105.33 °T,與模型預測值較為吻合,說明采用響應面法優化得到的益生菌山藥飲料發酵工藝條件準確可靠,可用于實際操作。

2.3 益生菌山藥飲料的冷藏穩定性

2.3.1 活菌數和酸度的變化 由表7可以看出,pH在4 ℃貯藏28 d期間均保持在3.71±0.10范圍內不變;滴定酸度在4 ℃貯藏28 d期間隨貯藏天數增加不斷升高;樣品中益生菌總活菌數在4 ℃貯藏28 d期間始終穩定在 108CFU/mL以上,28 d時最低,約為3.43×108CFU/mL。該飲料樣品在貯藏期內滴定酸度及活菌數變化規律與陳世賢等研究相符合[23]。

表7 益生菌山藥飲料樣品在4 ℃、28 d貯藏期內活菌數、pH及滴定酸度的變化Table 7 Changes of viable bacteria counts and acidity of probiotic yam beverage samples during storage at 4 ℃ for 28 days

2.3.2 感官品質的變化 由圖7可知,益生菌山藥飲料樣品在4 ℃、28 d貯藏期內飲料色澤始終保持淡黃,且澄清透明;飲料組織狀態良好,始終無分層現象;貯藏結束時飲料乳酸菌飲料特有的風味明顯;隨著貯藏時間的增加,酸度有所上升,但綜合口感仍在可接受范圍之內。綜上所述,益生菌山藥飲料在貯藏期內組織狀態良好、風味及口感穩定。

圖7 益生菌山藥飲料樣品在4 ℃、28d貯藏期內感官評價

3 結論

以山藥粉為原料,通過接種益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9進行發酵,研究發酵時間、接種量、發酵溫度對益生菌山藥飲料中活菌數、滴定酸度以及pH的影響,在此基礎上進行響應面優化,通過分析優化得出發酵時間對發酵山藥飲料滴定酸度及活菌數影響最大。經回歸分析并結合實際生產操作可行性后確定發酵益生菌山藥飲料最優生產工藝條件為接種量2×106CFU/mL、發酵時間19.1 h、發酵溫度37 ℃,在此條件下益生菌山藥飲料活菌數為4.3×108CFU/mL,滴定酸度為105.3 °T。對益生菌山藥飲料進行4 ℃、28 d貯藏實驗,結果表明:pH在4 ℃貯藏28 d期間均保持在3.71±0.1范圍內,與目前市售的活性乳酸菌飲料pH無顯著性差異;貯藏期間飲料益生菌總活菌數基本維持在108CFU/mL,且貯藏結束后飲料組織狀態穩定,質地保持均勻,無沉淀及分層現象。在此條件下發酵后制得益生菌山藥飲料色澤淡黃,澄清透明,且香氣濃郁、口感清爽,是一種兼具豐富營養價值與良好益生功能的活性益生菌飲料,具有良好的開發前景。