王 珊,馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

苦蕎(又稱(chēng)韃靼蕎麥,Fagopyrumtataricum),是我國(guó)重要的“藥食兩用”的小宗糧食作物[1],含有較高的淀粉、豐富的蛋白質(zhì)以及多種功能活性物質(zhì)。但苦蕎中含有蛋白酶抑制劑、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子,這些抗?fàn)I養(yǎng)因子是導(dǎo)致蛋白質(zhì)、淀粉消化率低,功能活性成分減少的主要原因之一[2-3]。有研究表明,苦蕎經(jīng)萌發(fā)處理,可降低蛋白酶抑制劑的含量,提高蛋白質(zhì)和淀粉的消化性,使氨基酸更為均衡,黃酮、酚酸和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等生物活性物質(zhì)富集[4-5]。苦蕎萌發(fā)第3 d時(shí),總淀粉含量下降不大,此時(shí)淀粉含量與大多數(shù)谷物相當(dāng),可提供碳源滿足發(fā)酵條件[6-7]。張雨薇等[8]對(duì)萌發(fā)前后蕎麥蛋白及氨基酸變化進(jìn)行研究,發(fā)芽處理可顯著提高蕎麥蛋白質(zhì)含量(平均增幅50.0%)、總氨基酸含量(平均增幅37.0%)。因此,萌發(fā)蕎麥?zhǔn)且环N較為合適的釀酒原料。

苦蕎萌發(fā)后,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高,更加有利于消化吸收。隨著苦蕎開(kāi)發(fā)利用,以萌發(fā)蕎麥作為發(fā)酵原料的研究逐漸增多,主要集中在萌發(fā)苦蕎酒或飲料等方面。孫常明等[9]以28 ℃培養(yǎng)3 d的萌發(fā)蕎麥為原料發(fā)酵制酒,將螞蟻提取物與蕎麥芽酒按比例勾兌獲得的保健酒口感醇厚,兼具酒香和藥香,是一種具有抗風(fēng)濕功能的新型保健酒。張燕莉[10]以21 ℃發(fā)芽72 h苦蕎芽為原料發(fā)酵制得的啤酒中,γ-氨基丁酸、總黃酮、總酚酸較原料中有所提高,且明顯高于市售啤酒。尉杰[11]以23 ℃光照培養(yǎng)3 d的萌發(fā)甜蕎為原料,經(jīng)發(fā)酵獲得酒精度為13.5% vol發(fā)芽甜蕎酒,其品質(zhì)較好。黃永光等[12]以25 ℃培養(yǎng)3 d的蕎麥芽和馬尾松花粉為原料,向酒液中加入馬尾松花粉進(jìn)行調(diào)配,獲得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料,其酒精度為6.2% vol,總黃酮含量為92.916 μg/mL。前人的研究主要集中在糖化、發(fā)酵、調(diào)配等方面,未將萌發(fā)培養(yǎng)后的苦蕎與發(fā)酵釀酒結(jié)合研究。

植物受到逆境脅迫時(shí),可刺激合成黃酮、酚酸、γ-氨基丁酸的關(guān)鍵酶活性,繼而促進(jìn)活性物質(zhì)進(jìn)一步積累,其中黃酮、酚酸在抗炎、抗衰老、降血糖、抑制腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用[13-16]。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可改善腦機(jī)能,同時(shí)具有降血壓、利尿[17-19]等作用,同時(shí),鹽脅迫是一種安全、環(huán)保的脅迫方式[20]。因此,本文將鹽脅迫與發(fā)酵結(jié)合,其中,萌發(fā)培養(yǎng)階段,以苦蕎為原料,考察培養(yǎng)溫度、光照時(shí)間、鹽種類(lèi)及濃度對(duì)萌發(fā)3 d苦蕎中總黃酮、總酚酸影響;糖化階段,以萌發(fā)苦蕎為原料,考察糖化溫度、糖化時(shí)間以及酶添加量對(duì)DE值(還原糖含量與總干物質(zhì)含量之比)的影響，同時(shí)研究了不同發(fā)酵天數(shù)的總黃酮、總酚酸、GABA的變化趨勢(shì),及成品酒的理化指標(biāo),以期為萌發(fā)苦蕎功能性保健酒研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黔苦1號(hào) 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;冰乙酸、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、氯化鋁、乙酸鉀、碳酸鈉 北京化工廠;硫酸銅 天津市福晨化學(xué)試劑廠;亞甲藍(lán) 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;酒石酸鉀鈉 西隴化工股份有限公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鄰苯二甲醛、乙酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;α-淀粉酶(3700 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;糖化酶(1000000 U/g) 阿拉丁(上海)有限公司;甲醛溶液(36%～38%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、GABA標(biāo)準(zhǔn)品、β-疏基丁醇、福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司;乙腈 色譜純，美國(guó)MREDA公司。

BSA224S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;WS-01恒溫恒濕培養(yǎng)箱 湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司;TDZ5M型臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙易達(dá)儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 邦西儀器科技(上海)有限公司;可調(diào)式封閉電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;德?tīng)柛咚俜鬯闄C(jī)、25 mL酸式滴定管、500 mL全玻璃蒸餾器、50 mL附溫度計(jì)密度瓶 上海信誼儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎種子萌發(fā)處理 選取籽粒飽滿,無(wú)霉變苦蕎種子,去離子水洗凈濾干,用1% NaClO消毒15 min,去離子水沖洗干凈,將去離子水沒(méi)過(guò)苦蕎種子并在30 ℃條件下水浴浸泡5 h。取出均勻放入平鋪有兩層紗布的托盤(pán)中。在一定溫度、光照時(shí)間、鹽種類(lèi)及濃度條件下,80%±5% RH恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,在45 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥12 h并過(guò)60目篩備用。

1.2.2 萌發(fā)苦蕎釀酒工藝流程 參考陳佳昕等[21]發(fā)酵工藝改進(jìn):

工藝操作要點(diǎn):糊化:稱(chēng)取一定質(zhì)量萌發(fā)苦蕎粉,按1∶5比例加入去離子水,充分震蕩混勻,置于90 ℃水浴鍋中不間斷晃動(dòng),糊化30 min;液化:糊化液中按1%加入α-淀粉酶,60 ℃、30 min條件下進(jìn)行液化;糖化:在一定溫度條件下,液化液中按一定添加量加入β-淀粉酶,糖化一定時(shí)間,糖化結(jié)束后于100 ℃中水浴10 min滅酶;酵母活化:取10倍于干酵母量的35 ℃ 2%的糖水復(fù)水活化30 min;酒精發(fā)酵:將活化好的酵母菌按接菌量為2.5%接入糖化液中,在28 ℃恒溫恒濕靜置發(fā)酵4 d。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將浸泡5 h的苦蕎種子分為若干份,每組平行做3份。以總黃酮、總酚酸為指標(biāo),考察KCl溶液濃度(5、10、15、20、25 mmol/L)、NaCl溶液濃度(10、20、30、40、50 mmol/L)、培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35 ℃)以及光照時(shí)間(2、4、6、8、10 h)對(duì)萌發(fā)苦蕎中功能活性物質(zhì)的影響。采用控制變量法,其中初始條件為KCl溶液濃度10 mmol/L、NaCl溶液濃度20 mmol/L、培養(yǎng)溫度15 ℃,每天用15 W白光光照2 h。培養(yǎng)3 d后烘干磨粉測(cè)總黃酮、總酚酸含量。

1.2.3.2 糖化條件單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 準(zhǔn)確稱(chēng)取若干份萌發(fā)苦蕎粉,每份3 g放于100 mL錐形瓶中,每組平行做3份。按照1∶5 (g/mL)料液比加入15 mL去離子水,放入90 ℃磁力攪拌器中糊化30 min,30 min后取出并用冷水冷卻至50 ℃,加入1%的α-淀粉酶60 ℃液化30 min,取出冷卻至40 ℃。以DE值為指標(biāo),考察糖化酶添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、糖化溫度(45、50、55、60、65、70 ℃)、糖化時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 h)對(duì)DE值的影響。采用控制變量法,其中初始條件為糖化酶添加量2.5%、糖化溫度55 ℃、糖化時(shí)間3 h,糖化結(jié)束后測(cè)定還原糖含量。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.2.4.1 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以KCl濃度(A)、培養(yǎng)溫度(B)、光照時(shí)間(C)三個(gè)因素為自變量,總黃酮和總酚酸為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案,各因素及水平見(jiàn)表1。

表1 萌發(fā)階段響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Levels and factors of the response surface experiment in germination stage

1.2.4.2 糖化階段的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以糖化時(shí)間(A)、糖化溫度(B)、酶添加量(C)三個(gè)因素為自變量,DE值為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案,各因素及水平見(jiàn)表2。

表2 糖化階段響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and level of the response surface experiment in saccharification stage

1.2.5 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.5.1 總黃酮含量測(cè)定 參照萬(wàn)燕等[22]的方法并加以改進(jìn)測(cè)定總黃酮含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,70%乙醇溶液定容至100 mL,得0.2 mg/mL蘆丁母液。從蘆丁母液中分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于20 mL具塞試管中,加入2 mL 0.1 mol/L三氯化鋁、3 mL 1 mol/L醋酸鉀溶液、70%乙醇定容至10 mL,搖勻,靜置30 min后于420 nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=6.1325x+0.0066(R2=0.9996),其中x為質(zhì)量(mg),y為吸光度值。

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g萌發(fā)苦蕎粉,以1∶70比例加入70%乙醇35 mL,在700 W、40 Hz、50 ℃超聲條件下提取20 min,將試樣在4000 r/min 離心10 min,得總黃酮提取液。從總黃酮提取液中取0.5 mL于20 mL具塞試管,參照上述步驟測(cè)定吸光度。

式中:Y1為總黃酮含量(mg/g);X1為提取液中總黃酮質(zhì)量(mg);m為萌發(fā)苦蕎粉重量(g);V取為提取液中移取體積;V定為提取液總體積。

1.2.5.2 總酚酸含量測(cè)定 參照汪雪嬌等[23]的方法并加以改進(jìn)測(cè)定總酚酸含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取25 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,70%乙醇定容至100 mL,得到0.25 mg/mL沒(méi)食子酸母液。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒(méi)食子酸母液于20 mL具塞試管中,用70%乙醇補(bǔ)足5 mL,加入1 mL福林酚和3 mL 15%碳酸鈉溶液,用去離子水定容至20 mL,避光顯色1 h,在765 nm處測(cè)吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.0931x+0.0095(R2=0.999),其中:x為質(zhì)量(mg),y為吸光度值。

發(fā)芽苦蕎粉總酚酸提取液參照1.2.5.1,測(cè)定步驟同上。

式中:Y2為總酚酸含量(mg/g);X2為提取液中總酚酸質(zhì)量(mg);m為萌發(fā)苦蕎粉重量(g);V取為提取液中移取體積;V定為提取液總體積。

1.2.5.3 DE值的計(jì)算 還原糖的測(cè)定參照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》中的直接滴定法,以堿性酒石酸溶液標(biāo)定,葡萄糖計(jì)。

DE參照馬坤[24]的方法測(cè)定。取20 mL酶解液在100 ℃下干燥至恒重,測(cè)其總干物質(zhì)含量,還原糖與總干物質(zhì)含量之比為DE值。

1.2.6 酒精度、功能活性物質(zhì)及抗氧化性測(cè)定

1.2.6.1 酒精度 采用GB 5009.225-2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》密度瓶法進(jìn)行酒精度測(cè)定。

1.2.6.2 GABA含量 采用外標(biāo)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確配制0.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,從中各取1 mL標(biāo)準(zhǔn)液于4 mL小離心管中,加入50 μL的鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)衍生液充分振蕩,靜置5 min,用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=22411x+76112(R2=0.9962),所測(cè)濃度范圍為0～200 μg/mL,其中:x為濃度(μg/mL),y為峰面積。

根據(jù)郭曉蒙等[25]方法改進(jìn),將發(fā)酵結(jié)束后樣品在4000 r/min離心10 min,吸取上清液1 mL置于4 mL小離心管中,50 μL OPA柱前衍生,混勻并靜止5 min,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。參照QB/T 4587-2013洗脫程序,如表3。日本島津,ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相A:0.02 mol/L乙酸鈉;流動(dòng)相B:乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng):338 nm;進(jìn)樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min,柱溫:40 ℃。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution program

1.2.6.3 DPPH自由基清除率 參照盧美歡等[26]的方法加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg DPPH,用無(wú)水乙醇溶解并定容至250 mL,避光保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。將發(fā)酵結(jié)束后的樣品在4000 r/min離心10 min,取2 mL樣品上清液置于20 mL具塞試管中,加入2 mL DPPH溶液,搖勻,黑暗放置30 min,以無(wú)水乙醇為空白,用紫外分光光度計(jì)于517 nm測(cè)其吸光度Ai;取2 mL樣品與2 mL無(wú)水乙醇混合均勻黑暗靜置30 min測(cè)定吸光度Aj;2 mL DPPH與2 mL無(wú)水乙醇混合溶液相同條件下測(cè)定吸光度Ac。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

1.2.7 萌發(fā)苦蕎酒理化指標(biāo)的測(cè)定

1.2.7.1 總酸、氨基酸態(tài)氮、pH 參照GB/T 13662-2018。將1.2.2發(fā)酵結(jié)束的樣品在4000 r/min離心10 min,取10 mL上清液于150 mL燒杯中,加入無(wú)二氧化碳的水50 mL,置于磁力攪拌器上,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定,直至pH=8.20為滴定終點(diǎn),記下消耗氫氧化鈉體積(V1)。向溶液中加入甲醛溶液10 mL,繼續(xù)用氫氧化鈉滴定,直至pH=9.20,記下加甲醛后消耗氫氧化鈉體積(V2)。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn),分別記錄不加甲醛及加入甲醛溶液時(shí),空白實(shí)驗(yàn)消耗氫氧化鈉體積(V3、V4)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值。取上清液,采用pH計(jì)測(cè)定pH,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值。

式中,V0為吸取樣品體積(mL);V1為測(cè)定樣品時(shí),消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);V3為空白實(shí)驗(yàn)消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);C1為氫氧化鈉溶液濃度(mol/L);M1為乳酸的摩爾質(zhì)量(g/mol)(M1=90)。

式中,V0為吸取樣品體積(mL);V2為加入甲醛后,測(cè)定樣品時(shí)消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);V4為加入甲醛后,空白實(shí)驗(yàn)時(shí)消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);C2為氫氧化鈉溶液濃度(mol/L);M2為氮的摩爾質(zhì)量(g/mol)(M2=14)。

1.2.7.2 致病菌檢測(cè) 金黃色葡萄球菌參照GB 4789.10-2016;沙門(mén)氏菌參照GB 4789.4-2016。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件的確定

2.1.1 培養(yǎng)溫度對(duì)萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量的影響 由圖1可知,培養(yǎng)溫度在15～35 ℃范圍內(nèi),總黃酮和總酚酸的含量隨溫度的變化趨勢(shì)均為先上升后下降。其中,總黃酮含量在20 ℃時(shí)達(dá)到最大,為13.29 mg/g,總酚酸含量在25 ℃時(shí)達(dá)到最大,為15.98 mg/g,在適宜溫度條件下,酶活力增加,黃酮、酚酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物得到富集。溫度超過(guò)25 ℃后,兩者的含量下降趨勢(shì)明顯,這是因?yàn)闇囟壬?合成黃酮、酚酸的關(guān)鍵酶-苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性下降[27],導(dǎo)致黃酮、酚酸類(lèi)物質(zhì)含量減少。因此,適宜培養(yǎng)溫度為20 ℃。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量

2.1.2 光照時(shí)間對(duì)萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量的影響 由圖2可知,每天光照時(shí)間在2～4 h時(shí),總黃酮、總酚酸含量呈上升趨勢(shì),光照4 h時(shí),兩者含量均達(dá)到最大值,其中總黃酮含量為12.56 mg/g,總酚酸含量為14.03 mg/g,有研究表明[28-29],光照能在苦蕎萌發(fā)階段提供能量,合成黃酮類(lèi)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶-PAL和CHI活性提高,有利于合成次級(jí)代謝產(chǎn)物。光照時(shí)間在4～10 h時(shí),兩者含量呈下降趨勢(shì),原因可能是黃酮、酚酸類(lèi)物質(zhì)分解合成其他物質(zhì)[30]。因此,最佳光照時(shí)間為4 h。

圖2 不同光照時(shí)間下萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量

2.1.3 鹽種類(lèi)及濃度對(duì)萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量的影響 由圖3a可知,KCl濃度在5～20 mmol/L時(shí),總黃酮、總酚酸均呈上升趨勢(shì),KCl濃度為20 mmol/L時(shí),兩者含量達(dá)到最大值,其中總黃酮含量為13.29 mg/g,總酚酸為16.17 mg/g。KCl濃度在20～25 mmol/L時(shí),兩者均呈下降趨勢(shì),說(shuō)明適當(dāng)?shù)柠}脅迫處理,有利于刺激PAL和CHI活性,增加黃酮、酚酸含量[22],當(dāng)KCl濃度再增加時(shí),細(xì)胞內(nèi)外滲透壓加大導(dǎo)致細(xì)胞脫水,加劇鹽脅迫傷害,這與劉建新等[31]的研究結(jié)果一致。由圖3b可知,NaCl濃度10～40 mmol/L時(shí),總黃酮和總酚酸含量呈上升趨勢(shì),在NaCl 濃度為40 mmol/L時(shí)達(dá)到最大,此時(shí)總黃酮含量為12.34 mg/g,總酚酸為15.16 mg/g。NaCl濃度40～50 mmol/L時(shí),兩者含量呈下降趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)萌發(fā)3 d的苦蕎進(jìn)行不同種類(lèi)鹽處理,發(fā)現(xiàn)在同一濃度條件下,經(jīng)KCl脅迫后,萌發(fā)苦蕎中黃酮、酚酸類(lèi)等物質(zhì)含量高于經(jīng)NaCl脅迫處理,K+、Na+與合成黃酮、酚酸類(lèi)的關(guān)鍵酶之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。因此,最佳鹽種類(lèi)及濃度為20 mmol/L KCl。

圖3 不同鹽脅迫對(duì)萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸的影響

2.2 苦蕎萌發(fā)培養(yǎng)條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 萌發(fā)苦蕎的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以KCl濃度(A)、溫度(B)、時(shí)間(C)為自變量,總黃酮(Y1)、總酚酸(Y2)為指標(biāo)進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results Germination culture conditions of buckwheat by response surface experiment

2.2.2 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件回歸方程及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,分別得到各個(gè)因素對(duì)樣品總黃酮和總酚酸兩個(gè)指標(biāo)的二次回歸方程分別如下:

黃酮含量=14.52-0.28A-0.35B+0.094C-0.43AB+0.5AC-0.69BC-1.32A2-2.14B2-1.75C2

酚酸含量=16.54-0.036A-0.24B+0.47C-0.18AB-0.92AC-0.58BC-0.19A2-2.88B2-2.15C2

表5 總黃酮、總酚酸的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of variance for the response surface experiment of total flavonoids and total phenolic

2.2.3 各因素交互作用分析 由Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),剔除不顯著項(xiàng)得到圖4。KCl和光照時(shí)間交互作用產(chǎn)生的等高線圖為橢圓狀,表明兩者交互作用對(duì)總酚酸含量影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。固定KCl與培養(yǎng)溫度,隨著光照時(shí)間延長(zhǎng),總酚酸含量呈先上升后下降趨勢(shì),同時(shí)得出酚酸含量對(duì)光照時(shí)間的變化比KCl的變化敏感。

圖4 KCl和光照時(shí)間的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.4 最佳萌發(fā)培養(yǎng)條件確定 由Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出總黃酮、總酚酸的最佳提取條件為:KCl濃度19.5 mmol/L、培養(yǎng)溫度24.68 ℃、光照時(shí)間4.17 h,在此條件下預(yù)測(cè)的總黃酮含量為14.54 mg/g,總酚酸為16.57 mg/g。考慮到實(shí)際情況,將原有的理論模型修改為:20 mmol/L KCl、培養(yǎng)溫度25 ℃、光照時(shí)間4 h,在此條件下,總黃酮含量為(14.70±0.08) mg/g,總酚酸含量為(16.78±0.05) mg/g。

2.3 萌發(fā)苦蕎酒糖化工藝的優(yōu)化

2.3.1 糖化溫度對(duì)DE值的影響 由圖5可知,糖化溫度在45～60 ℃時(shí),DE值呈上升趨勢(shì),在60 ℃時(shí)達(dá)到最大,此時(shí)DE值為22.36%,說(shuō)明溫度對(duì)于酶活性有重要作用,溫度適宜酶活力升高,在固定時(shí)間內(nèi)分解產(chǎn)生更多葡萄糖[21]。糖化溫度在60～70 ℃時(shí),DE值呈下降趨勢(shì),表明溫度升高,破壞酶活性,從而水解淀粉能力下降,DE值降低。因此,最佳糖化溫度為60 ℃。

圖5 糖化溫度對(duì)DE值的影響

2.3.2 酶添加量對(duì)DE值的影響 由圖6可知,在溫度、酶解時(shí)間以及底物濃度固定時(shí),酶添加量在0.5%～2.5%時(shí),隨著酶添加量的增加,DE值呈上升趨勢(shì),并在2.5%添加量時(shí)DE值達(dá)到最大,為22.51%。酶添加量在2.5%～3%時(shí),酶解效果達(dá)到飽和,DE值基本保持不變[31]。因此,最佳酶添加量為2.5%。

圖6 酶添加量對(duì)DE值的影響

2.3.3 糖化時(shí)間對(duì)DE值的影響 由圖7可知,糖化時(shí)間在0.5～3 h時(shí),DE值呈上升趨勢(shì),且在2～3 h間上升速率較大,表明此階段是生成還原糖關(guān)鍵時(shí)期,糖化時(shí)間為3 h時(shí),DE值達(dá)到最大為23.56%,表明在溫度、酶添加量以及底物濃度固定時(shí),糖化3 h底物分解徹底,產(chǎn)生的還原糖達(dá)到最大程度[32]。糖化時(shí)間在3～5 h時(shí),DE值趨于穩(wěn)定,表明苦蕎中淀粉已最大程度分解完成。因此,最佳糖化時(shí)間為3 h。

圖7 糖化時(shí)間對(duì)DE值的影響

2.4 糖化工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 糖化工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以糖化時(shí)間(A)、糖化溫度(B)、酶添加量(C)為自變量,DE值為指標(biāo),進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 糖化工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 The response surface design and results of saccharification process

2.4.2 糖化工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到各個(gè)因素對(duì)樣品DE值指標(biāo)的二次回歸方程分別如下:

DE值=23.58+1.54A-0.25B+0.80C-0.23AB-0.25AC-0.78BC-1.08A2-1.69B2-0.081C2

由表7中可知,模型DE值的p值<0.0001，表明該模型差異顯著。失擬項(xiàng)p=0.4127>0.05,沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明該模型擬合性良好。該模型的決定系數(shù)R2=0.9807>0.8,表明該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面。由回歸方程和方差分析可知,模型中A、C、BC、A2、B2對(duì)DE值影響極顯著(p<0.01),B、AB、AC、C2對(duì)DE值影響不顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,A、B、C三因素所對(duì)應(yīng)的F值越大,說(shuō)明該因素對(duì)DE響應(yīng)值的影響越大[33]。因此可知影響DE值順序?yàn)锳>C>B,即糖化時(shí)間>酶添加量>糖化溫度。

表7 DE值的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析Table 7 Analysis of variance for the response surface experiment of DE

2.4.3 響應(yīng)面中各因素對(duì)DE值的結(jié)果分析 由Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),剔除不顯著項(xiàng)得到如圖8。糖化溫度和酶添加量交互作用產(chǎn)生的等高線圖為橢圓狀,表明兩者交互作用對(duì)DE值影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。固定酶添加量及糖化時(shí)間,隨著溫度升高,DE值呈先上升后下降趨勢(shì),這與酶的本質(zhì)相關(guān),同時(shí)得出DE值對(duì)酶添加量的變化比溫度的變化敏感。

圖8 糖化溫度和酶添加量的響應(yīng)面及等高線圖

2.4.4 最佳糖化工藝條件確定 由Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出DE值的最佳糖化條件為:時(shí)間3.63 h、糖化溫度58.26 ℃、酶添加量3%,在此條件下預(yù)測(cè)的DE值為24.89%,考慮到實(shí)際情況,將原有的理論模型修改為:糖化時(shí)間3.5 h、糖化溫度58 ℃、糖化酶添加量3%,在此條件下,DE值為24.13%±0.02%。

2.5 不同發(fā)酵天數(shù)酒精度、功能活性物質(zhì)及抗氧化性變化

由圖9a可知,萌發(fā)苦蕎酒在發(fā)酵1～4 d時(shí),酒精度呈上升趨勢(shì),并在發(fā)酵第4 d時(shí),酒精度達(dá)到最大值,為8.83%±0.11% vol;在4～7 d時(shí),酒精度略有下降。因此,萌發(fā)苦蕎酒發(fā)酵時(shí)間為4 d。

圖9 不同發(fā)酵天數(shù)酒精度、功能活性物質(zhì)及抗氧化性變化

由圖9b可知,苦蕎芽發(fā)酵時(shí),總黃酮、總酚酸以及GABA含量處于動(dòng)態(tài)變化,其中總黃酮含量隨著發(fā)酵天數(shù)延長(zhǎng),呈下降趨勢(shì),在發(fā)酵第4 d時(shí),酒液中總黃酮濃度減少至(1.458±0.015) mg/100 mL,這可能與黃酮極性相關(guān);總酚酸、GABA含量隨著發(fā)酵天數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致,呈先上升后下降趨勢(shì),并均在發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到最大值,分別為(33.33±0.02)、(15.74±0.03) mg/100 mL;DPPH自由基清除率在發(fā)酵第3 d時(shí)達(dá)到最大,為90.15%±0.01%。

萌發(fā)苦蕎經(jīng)過(guò)4 d發(fā)酵,在發(fā)酵結(jié)束第4 d時(shí),總黃酮含量為(1.458±0.015) mg/100 mL,總酚酸含量為(24.93±0.01) mg/100 mL,GABA含量為(12.33±0.012) mg/100 mL,DPPH自由基清除率為85.22%±0.01%。

2.6 最優(yōu)條件下萌發(fā)苦蕎酒理化指標(biāo)

萌發(fā)苦蕎經(jīng)過(guò)4 d發(fā)酵后,酒精度約為8.8% vol,pH、總酸(以乳酸計(jì))、氨基酸態(tài)氮結(jié)果均達(dá)到清爽型半甜黃酒標(biāo)準(zhǔn),同時(shí),金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌未檢出。因此,萌發(fā)苦蕎酒總體符合黃酒(GB/T 13662-2018)的標(biāo)準(zhǔn)。

表8 萌發(fā)苦蕎酒基本理化指標(biāo)Table 8 Basic physical and chemical indicators of germinated buckwheat wine

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn),分別對(duì)苦蕎萌發(fā)培養(yǎng)條件和萌發(fā)苦蕎酒糖化工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定苦蕎萌發(fā)培養(yǎng)條件為20 mmol/L KCl、培養(yǎng)溫度25 ℃、光照時(shí)間4 h,在此萌發(fā)條件下,萌發(fā)苦蕎總黃酮含量為(14.70±0.08) mg/g,總酚酸含量為(16.78±0.05) mg/g;最佳糖化工藝為糖化酶添加量3%、糖化溫度58 ℃、糖化時(shí)間3.5 h,在此糖化條件下,DE值為24.13%±0.02%。萌發(fā)苦蕎發(fā)酵4 d后,酒精度為8.83%±0.11% vol,總黃酮含量為(1.458±0.015) mg/100 mL,總酚酸含量為(24.93±0.01) mg/100 mL,GABA含量為(12.33±0.012) mg/100 mL,DPPH自由基清除率為85.22%±0.01%,口感醇厚,是一種較好的低度型萌發(fā)苦蕎酒,為低醇度酒釀造工藝提供一定理論基礎(chǔ)。