錦橙中β-葡萄糖苷酶的提取純化及其結構表征

任婧楠,范 剛,張璐璐,潘思軼,王可興

(環境食品學教育部重點實驗室,華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又稱為β-D-葡萄糖苷水解酶,它包含一個異構組的酶,能水解雙糖或低聚糖的β-葡萄糖苷鍵及其他的葡萄糖共軛鍵使其斷開,從而釋放出糖苷及其配基[1]。β-葡萄糖苷酶廣泛分布于自然界生物中,如植物、昆蟲、酵母、霉菌和細菌[2-3],并在許多生命過程中都扮演著關鍵角色。例如香氣的釋放[4-5],異黃酮苷的水解[6],花色苷配體的釋放[7],纖維素生物質的降解[8],生氰作用[9]等過程,β-葡萄糖苷酶還被認為在細胞壁降解的過程中起到一定的作用[10]。一些植物來源的β-葡萄糖苷酶具有高度的底物專一性[11]。β-葡萄糖苷酶的相對分子質量一般在40～250 kDa之間,不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對分子質量有很大差異,這是由于它們在不同的生物體中的結構和組成不同[12]。不同來源的β-葡萄糖苷酶的活性也存在差異,Dong等[13]從Paenibacillus菌株分離的β-葡萄糖苷酶的活性達15.40 U/mg。

目前國內外的研究學者已經對各種來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學性質進行了大量的研究[14],然而,柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究還比較少。據報道,β-葡萄糖苷酶分布于柑橘果實的各個部位,在柑橘果實鍵合態香氣水解釋放、檸檬苦素類物質糖苷水解及花色苷降解過程中起到重要作用[14]。Ren等[15]研究了柑橘生長過程中β-葡萄糖苷酶的酶活變化,并發現柑橘在成熟過程中β-葡萄糖苷酶酶活呈上升趨勢。柑橘不同組織部位中β-葡萄糖苷酶的活性也是不同的。Burns和Baldwin[16]研究發現葡萄柚白皮層中β-葡萄糖苷酶活性最高,其次為果皮,而果汁中的活性最低。Barbagallo等[17]研究發現血橙果肉中β-葡萄糖苷酶的酶活高于離心果汁中的酶活,由此得出結論,柑橘中的β-葡萄糖苷酶主要與固態部分結合緊密,有可能與果膠鏈結合在一起。

目前,國內外的研究學者已經對各種來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學性質進行了大量的研究,如玉米秸稈[18]、橄欖[19]、橡膠樹[20]、杏[21]。然而,對于柑橘中β-葡萄糖苷酶的研究還比較少。本文以錦橙為原料,對其果皮與果肉中的β-葡萄糖苷酶分別進行提取純化,并進行結構表征,為β-葡萄糖苷酶在影響柑橘品質方面的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

錦橙 采自重慶市,選取樹勢健壯、生長結果正常的果樹摘取果實,果實可固含量為11 °Brix,總酸0.78%;檸檬酸、磷酸氫二鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、硫酸銨、氫氧化鈉、碳酸鈉、對硝基苯酚-β-葡萄糖醛酸苷(p-NPG)、碳酸氫鈉、鹽酸、Tris、乙酸、聚乙二醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;DEAE-瓊脂糖凝膠 北京欣經科生物技術有限公司。

Eppendorf高速冷凍離心機 北京博儀恒業科技發展有限公司;BSZ-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;DU700紫外-可見光分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司;Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀 美國伯樂公司;MK-3多功能酶標儀 美國Thermo Scientific公司;XGT-1000WRX熒光光譜儀 日本Horiba公司;Zetasizer Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 錦橙果皮和果肉中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制備 根據前期預實驗結果,在橙皮或果肉中加入一定量(橙皮∶緩沖液=1∶2)的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)和10%的PVPP,移入榨汁機中榨汁5 min,將所得勻漿于4 ℃下浸提過夜,然后在6000 g的條件下冷凍離心15 min,結束后取上清液。

1.2.2β-葡萄糖苷酶的硫酸銨沉淀 參照宋娜娜等[22]的方法,并作適當修改。向1.2.1中的粗酶液中緩慢加入25%飽和度的硫酸銨溶液,于4 ℃靜置過夜,4 ℃、6000 g離心15 min,收集上清液。然后向上清液中加入90%飽和度的硫酸銨溶液,于4 ℃靜置過夜,4 ℃、6000 g離心15 min,收集沉淀,將沉淀溶于適量pH6.0、檸檬酸-磷酸緩沖液中。

1.2.3 透析法除鹽、濃縮 將透析袋剪為20 cm左右,置于2%(W/V)碳酸氫鈉和1.0 mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸10 min,蒸餾水清洗之后,再于1.0 mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸,冷卻之后存于4 ℃。將1.2.2中的緩沖液移至透析袋中,蒸餾水作為透析液,每4～6 h更換一次透析液,透析過夜,收集透析袋中的溶液。將透析所得溶液仍裝入透析袋中,用聚乙二醇覆蓋透析袋脫水至體積≤25 mL[23]。

1.2.4 DEAE-Sepharose柱層析 濃縮酶液上樣于已用Tris-HCl(0.05 mol/L,pH8.2)緩沖液平衡的DEAE-sepharose層析柱中(φ 1.6 cm×30 cm)。先后用1000 mL 0.35 mol/L NaCl溶液(溶于平衡緩沖液)和1000 mL 0.4 mol/L NaCl溶液(溶于平衡緩沖液)進行洗脫,流速3.0 mL/min,分別收集0.35 mol/L NaCl洗脫液和0.4 mol/L NaCl洗脫液,每管3 mL。以管號為橫坐標,酶活為縱坐標,繪制洗脫曲線。

1.2.5β-葡萄糖苷酶活性測定 采用1.0 mol/L的Na2CO3溶液作為溶劑,分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 μmol/mL的對硝基苯酚標準溶液。以蒸餾水為對照,在紫外可見區域掃描各個濃度的最大吸收峰。以對硝基苯酚的濃度為橫坐標,以在最大吸收波長405 nm處的吸光度為縱坐標繪制對硝基苯酚的標準曲線。

參照孫艷梅等和羅小娟等[24-25]的方法,并稍作修改。將3 mL 10 mmol/L的p-NPG加入到20 mL的酶液中,在適宜溫度下進行反應,在1 min后通過加入1.0 mL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3溶液來終止反應,然后在400 nm波長處測定吸光度。利用對硝基苯酚的標準曲線方程可以計算出所生成的對硝基苯酚的濃度。β-葡萄糖苷酶的酶活單位為U/g,定義1 U為在一定條件下,以p-NPG為底物,每分鐘釋放出1.0 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

1.2.6 酶液中蛋白質濃度的測定 采用考馬斯亮藍G-250比色法。標準曲線的繪制:以Tris-HCl(0.05 mol/L,pH8.2)緩沖液作為空白,牛血清白蛋白作為標準樣品。以Tris-HCl(0.05 mol/L,pH8.2)緩沖液做溶液,分別配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。移取空白溶液以及標準樣品溶液各50 μL,分別加入200 μL考馬斯亮藍溶液,立即放入酶標儀中于595 nm下測定吸光度。以標準樣品濃度作為橫坐標,相應吸光度作為縱坐標,繪制標準曲線。

將所得各份酶液各取50 μL,分別加入200 μL考馬斯亮藍溶液,立即放入酶標儀中于595 nm下測定吸光度。根據標準曲線可得出各濃縮酶液中蛋白質濃度。

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量 參照劉穎等[26]的方法,并做適當修改。先加入15%的分離膠,使其略高于凝膠板上所劃分離線,再加入少量蒸餾水。靜置1 h后,倒掉蒸餾水,加入5%濃縮膠,立即插入梳子。靜置20 min后,平衡地移除梳子,加入電泳液直至加滿。此時將配制好的樣品用微量進樣器加入槽中(20～25 μL),并用微量進樣器取10 μL蛋白質Marker加入另一槽中。將電泳槽放入外殼中,并向其中加入約體積一半的電泳液。封蓋,通電,調節A=15 mA,U=80 V,電泳開始。待樣品移動到分離膠時,調節A=30 mA,U=100 V。待樣品移動到距凝膠板約1.0 cm時,可停止電泳。根據樣品條帶以及蛋白質Marker 條帶,即可得出所測酶的分子量。

1.2.8 熒光光譜分析 配制蛋白質濃度為0.4 mg/mL的酶液,采用熒光光譜儀進行熒光測定,測定時先在350 nm發射波長下掃描得到其最大激發波長,然后用最大激發波長對蛋白質進行掃描得到各發射光譜。激發光譜的操作條件為:掃描范圍200～500 nm,掃描速度200 nm/min,激發狹縫和發射狹縫寬均為10 nm,響應時間0.1 s,記錄數據波長間隔為1 nm。

1.2.9 粒徑測定 采用納米粒度及Zata電位分析儀進行粒徑的測定,散射光為波長532 nm的激光,激光反射角為15°,測定蛋白質濃度為0.4 mg/mL的酶液的粒徑,每組測量重復三次。

1.3 數據處理

三次平行實驗測定得到的各實驗平均值及標準偏差采用Microsoft Office Excel 2010進行計算,并使用SPSS Statistics 24進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl溶液洗脫效果的比較

根據對硝基苯酚標準曲線,得到對硝基苯酚標準曲線的回歸方程為:Y=16.966X+0.0165(Y為對硝基苯酚在最大吸收波長處的吸光度,X為對硝基苯酚的濃度(μmol/mL))。相關系數R2=0.9997。根據對硝基苯酚標準曲線的回歸方程測定各管洗脫液中β-葡萄糖苷酶的活性。

不同濃度NaCl洗脫液洗脫得到的果皮中β-葡萄糖苷酶的酶活如圖1所示,0.35 mol/L NaCl洗脫得到的第13管酶液的酶活最高,達15.3×10-3U/g,收集得到的所有15管酶液的平均酶活為(6.57±4.27)×10-3U/g。0.4 mol/L NaCl洗脫得到的第9管酶液的酶活最高,最高達5.33×10-3U/g,收集得到的所有12管酶液的平均酶活為(3.49±0.92)×10-3U/g。顯著性分析結果顯示,果皮中0.35 mol/L NaCl洗脫液中β-葡萄糖苷酶的平均酶活顯著高于0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性(p<0.05)。

圖1 果皮中不同濃度NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性

不同濃度NaCl洗脫液洗脫得到的果肉酶活如圖2所示,0.35 mol/L NaCl洗脫得到的第7管酶液的酶活最高,達7.28×10-3U/g,收集得到的所有17管酶液的平均酶活為(4.66±1.35)×10-3U/g。而0.4 mol/L NaCl洗脫得到的第9管酶液的酶活最高,僅為4.69×10-3U/g,收集得到的所有17管酶液的平均酶活為(3.81±0.56)×10-3U/g。果肉中0.35 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶的平均酶活高于0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶的平均酶活,但是沒有顯著性差異(p>0.05)。

圖2 果肉中不同濃度NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性

此外,果皮中0.35 mol/L NaCl洗脫液中β-葡萄糖苷酶的平均酶活顯著高于同一濃度NaCl溶液洗脫得到的果肉中的酶活(p<0.05)。而果皮中0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶酶活與同一濃度NaCl溶液洗脫得到的果肉中的酶活沒有顯著性差異(p>0.05)。這說明過高濃度NaCl洗脫對所得的β-葡萄糖苷酶的酶活會造成抑制作用,且0.35 mol/L NaCl洗脫得到的果皮中的酶活顯著高于果肉中的酶活。相同的結果也在Burns和Baldwin[16]的研究中得到,他們發現葡萄柚果皮中β-葡糖糖苷酶的活性高于果肉。Barbagallo等[17]發現血橙果肉中β-葡糖糖苷酶的酶活(1.5×10-3U/g)高于果汁中的酶活,其原因可能是由于柑橘中的β-葡糖糖苷酶主要與固態部分緊密結合,有可能是與果膠結合在一起。然而其酶活低于本文中檢出的錦橙果肉和果皮中的酶活,其原因與所用柑橘原料的品種、提取純化條件等都有關。

2.2 純化酶液中蛋白質濃度

牛血清白蛋白標準曲線的回歸方程為:Y=6.2957X+0.3644(Y為牛血清白蛋白在最大吸收波長處的吸光度,X為牛血清白蛋白的濃度),相關系數R2=0.9918。由表1可知,不同濃度NaCl溶液洗脫得到的果皮和果肉酶液的蛋白質濃度存在一定差異,0.35 mol/L NaCl洗脫得到的果皮酶液中蛋白質濃度是0.4 mol/L NaCl洗脫液中蛋白質濃度的2.4倍,且采用0.35 mol/L NaCl洗脫得到的果肉酶液蛋白質濃度也比0.4 mol/L NaCl洗脫液中蛋白質濃度高。因此后續實驗采用0.35 mol/L NaCl洗脫酶液。

表1 不同濃度NaCl洗脫果皮和果肉酶液中的蛋白質濃度Table 1 The protein contents in different concentrations of NaCl eluent from pulp and peel

2.3 測定純化的β-葡萄糖苷酶的分子量

β-葡萄糖苷酶粗酶液經硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose柱層析之后得到純化的β-葡萄糖苷酶,經聚丙烯酰胺凝膠電泳只顯示一條帶(圖3),其分子量略高于170 kDa,粗略估計為170～250 kDa之間。不同來源的β-葡萄糖苷酶的分子量也不一樣,Zhang等[27]測出經重組的大腸桿菌中的β-葡萄糖苷酶的分子量為52 kDa,Sathe等[28]分離純化了Methylococcus capsulatus中的β-葡萄糖苷酶,并測得其分子量為50.7 kDa,Kar等[3,21]從Putranjiva roxburghii中發現β-葡萄糖苷酶的分子量約為66 kDa。

圖3 純化的果皮β-葡萄糖苷酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.4 熒光光譜分析

β-葡萄糖苷酶酶液先在350 nm發射波長下掃描得到其最大激發波長290 nm,再在290 nm激發波長下掃描得到熒光光譜。如圖4所示,根據熒光光譜結果可知,β-葡萄糖苷酶的最大熒光吸收峰在582 nm左右。熒光光譜分析法是研究蛋白質分子構象的一種有效方法,具有靈敏度高、選擇性強、重現性好、試樣量少和方法簡便等優點[29]。劉宇等[30]發現橡膠籽中β-葡萄糖苷酶的熒光峰為335 nm左右,低于本文中的結果。最大熒光吸收峰的不同與蛋白質結構中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸存在密切的關系[29]。

圖4 β-葡萄糖苷酶的熒光光譜分析

2.5 粒徑分布測定

β-葡萄糖苷酶酶液的粒度分布如圖5所示,可以看出,該酶的粒徑范圍約為5～25 nm。該酶體系的粒徑分布曲線呈正態分布形態,是一種比較穩定的體系狀態。有關β-葡萄糖苷酶粒徑分布的研究很少。體系中蛋白質的粒徑分布受到很多因素的影響,進而影響其功能作用。齊寶坤等[31]研究發現大豆分離蛋白的表面疏水性與粒徑大小之間存在極顯著的線性負相關。蛋白質的粒徑分布較大,說明蛋白分子之間相互聚集形成較多聚集體,這會使蛋白質的疏水基團內卷,減少蛋白質分子表面疏水基團的暴露[32],從而導致蛋白質表面疏水性的降低[31]。有關體系中β-葡萄糖苷酶的粒度分布對其性質,尤其是酶活的影響還需進一步研究。

圖5 β-葡萄糖苷酶酶液的的粒徑分布

3 結論

不同濃度NaCl洗脫液洗脫得到的果皮中β-葡萄糖苷酶的酶活存在顯著差異,果皮中0.35 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性顯著高于0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性和果肉中的0.35 mol/L和0.4 mol/L NaCl洗脫液中的酶活(p<0.05),且0.35 mol/L NaCl洗脫液中的蛋白質濃度最高,達0.154 mg/mL。在該條件下提取得到的β-葡萄糖苷酶的分子量略高于170 kDa。β-葡萄糖苷酶的最大熒光吸收峰為582 nm,該酶的粒徑范圍為5～25 nm。