超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白生化特性的影響

楊巨鵬,呂春霞,雷葉斯,張慧恩,曹少謙,楊 華

(浙江萬里學院,浙江寧波 315100)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)俗名又稱大鮮、大黃花[1],資源豐富,且具有非常高的食用價值[2],是我國傳統意義上的四大海產之一。現今對大黃魚的研究主要集中在養殖、保鮮、魚肉深加工三個方面[3]。大黃魚蛋白質含量很高,擁有豐富的微量元素和多種維生素,對人體的滋補效果明顯。除了作為常用菜肴之外,還可以作為身體虛弱老人的一道食補菜,它含硒豐富,所以可以很大程度地消滅新陳代謝產生的自由基,延緩衰老,預防多種癌癥的發生[4]。中醫認為,大黃魚可以健脾胃、治痢疾、補氣、補精,不僅如此,它還對于貧血、失眠、頭暈、食欲不振等不良癥狀有很好的食療功效[5]。

超高壓技術(ultrahigh pressure,UHP)是一種新興食品加工技術,即將食品通過一定的液體介質(一般情況下為水、甘油等),在一定的溫度下對樣品采用100～1000 MPa高壓處理適當時間[6]。UHP屬于一項非熱加工技術,利用物理作用,避免熱加工的破壞作用,從而達到殺滅食品中的微生物、鈍化酶或使其部分失活、使蛋白質變性的效果,實現延長食品貨架期、保持食品原有營養成分與風味[7-8]的效果,現階段UHP已在諸多食品領域有所運用[9]。UHP可以把維持蛋白空間結構的各種化學鍵破壞,導致其空間結構改變,甚至使蛋白發生變性。目前,超高壓對養殖大黃魚肌動球蛋白生化特性的影響鮮有報道。鑒于此,本文通過研究超高壓處理后養殖大黃魚肌動球蛋白生化特性的變化,為科學加工大黃魚提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮死的養殖大黃魚(0.5～1.0 kg) 寧波市水產市場;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙酸、馬來酸(順丁烯二酸)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、1-苯胺基8-萘基碩酸鹽(ANS)、氯化鉀 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;5.5-二硫代雙-C2-硝基苯甲酸(DTNB BR)、EDTA Na2(乙二胺四乙酸二鈉)國藥集團化學試劑有限公司;Ca2+-ATPase酶測試盒(貨號:A070-4) 南京建成生物工程研究所。

Centrifuge 5804R離心機 德國Eppendorf;F-80高速粉碎機 姜堰市新康醫療器械有限公司;J-26XP高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特;Forma-725超低溫冰箱 艾本德中國有限公司;BCD-216ZDJ可調式冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司;UV2000 紫外分光儀 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;DK-8恒溫水浴鍋 上海維誠儀器有限公司;AFS-3100熒光分光光度計 北京市海光儀器有限公司;SYSTEM GelDoc XR+BIO-RAD凝膠成像儀 伯樂公司;HPP.M超高壓處理設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚肌動球蛋白的提取 取養殖大黃魚背部肌肉用絞碎機絞碎,取背部肌肉10 g,放入離心杯,再加入40 mL 4 ℃磷酸緩沖液(pH=7.5),充分攪拌后離心分離10 min,轉速6000 r/min,溫度4 ℃,取杯內的下部沉淀物,然后將此操作重復4次。然后向最后一次提取好的沉淀中加入60 mL pH7.5 mol/L的氯化鉀磷酸緩沖液。在4 ℃冰箱內靜置,時間為20 h,靜置期間用0.5 mol/L Na2HPO4控制pH為7.5,將提取液在8000 r/min 4 ℃的條件下離心分離15 min。然后取上清液用3層紗布過濾,只保留濾液。提前在容器中準備好10倍提取液體積的冷卻水,將提取液隨著容器壁慢慢地注入,并緩緩攪拌。此時溶液用5%乙酸調節pH,至5.5～5.6左右,靜置冷卻。上下分層明顯后,棄去上清液,再將沉淀下來的蛋白質在6000 r/min,4 ℃的條件下離心分離10 min。用容器收集蛋白,測定蛋白沉淀量,然后加入一定量3 mol/L的KCl溶液,使得KCl的最終濃度為0.6 mol/L,再用0.6 mol/L KCl-20 mmo1/L Tris-馬來酸緩沖液(pH=7.0)透析過夜,在11000 r/min,4 ℃的條件下離心分離15 min,所得上清液即為肌動球蛋白溶液,按照順序編號,放在4 ℃冰箱冷藏備用[10]。

首先對肌動球蛋白進行高壓蒸煮袋真空包裝,然后再用聚乙烯塑料進行第二次真空包裝,第一次裝不得留有氣泡或者頂隙,第二次包裝是為了防止破壞單層蒸煮袋。放入超高壓機器,在300、350、400 MPa下分別保壓3、6、9 min,取出后快速采用冰水進行冷卻,并進行理化性質分析,未用完的樣品放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 Ca2+-ATPase活性測定 采用南京建成生物工程研究所所提供的超微量Ca2+-ATPase酶測試盒(貨號:A070-4)實驗方法進行,酶活力單位的定義如下:

式中,酶的活力單位:微摩爾磷/毫克蛋白/小時(μmol Pi/mg prot/h);ATPase活力單位:U/mg prot;標準品濃度:0.02 μmol/mL;待測樣本蛋白濃度:mg prot/mL。

注:6:單位上是用小時,但是操作時間只有10 min,所以要乘以6;2.8:在反應體系中進行2.8倍的稀釋。

1.2.3 表面疏水性測定 用ANS熒光探針法測定表面疏水性[11]。用0.6 mol/L KCl-磷酸鹽緩沖液將肌動球蛋白稀釋成5個濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL),取2 mL樣品,在20 ℃孵育10 min,加入8 mmol/L ANS溶液10 μL,設定激發波長λex=390 nm(狹縫校正5 nm),發射波長λex=470 nm(狹縫校正5 nm),測定熒光強度。以熒光強度對蛋白質質量濃度作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質的表面疏水性指數(S0)。

PPP項目融資指的就是國家政府和個人企業為了公共設施的建設暫時達成的一種具有合作意義的關系。PPP項目最早是由英國政府為了緩解國內的資金流動，建設公共設施而提出的模式，這種模式能夠充分的利用民間資本極大的彌補資金上的短缺問題，從而降低投資上的風險問題。就目前國內發展現狀來說，我國還處于社會主義初期階段，各項公共基礎設施還不完善，建設資金也十分有限，所以才會引用PPP機制，使得我國的公共基礎設施建設得到了很好的發展。

1.2.4 活性巰基含量測定 參照朱東宏等[12]的實驗方法,并稍作修改。向1 mL蛋白樣液中加入9 mL的Tris-HCl(0.2 mol/L,pH6.8,10 mmol/L EDTA)緩沖液。取4 mL上述混合液,加入0.4 mL 0.1% DTNB溶液,在4 ℃的條件下靜置1 h后于412 nm下進行比色。空白樣液將蛋白樣液換成蒸餾水即可。活性巰基含量計算方法

式中,B是在除去試劑空白之后在412 nm處的吸光值;D是在此反應過程中稀釋的倍數,C為蛋白質濃度(mg/mL)。

1.2.5 蛋白質熱變性 將超高壓處理過的肌動球蛋白溶液進行冷凍干燥處理,所得肌動球蛋白固體樣品放入-20 ℃冰箱保存備用。用差示掃描量熱法(DSC)分析蛋白質熱變性[13]。精確稱取冷凍干燥處理過的肌動球蛋白固體樣品3～9 mg置于鋁坩堝中,記錄數值精確到1/10000 g,保持初始溫度為30 ℃,密封坩堝,放入儀器,進行測定。保持恒定的溫度5 min,加熱范圍為30～180 ℃,加熱速率為10 ℃/min,氮氣流量為100 mL/min,反應氣體流量50 mL/min,空坩堝作為對照樣,平行測定3次。

1.2.6 SDS-PAGE電泳的測定 取適量樣品,用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液調整濃度為1 mg/mL左右,取5 μL調整好的樣品,加入5 μL蛋白質上樣緩沖液,100 ℃加熱3 min,冷卻至室溫后取10 μL進行點樣,分離膠質量分數為12%,濃縮膠質量分數為5%。電泳結束標志為溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm處,關閉電源,取出凝膠。用0.1%的考馬斯亮藍R-250對凝膠進行染色20 min,用25%的甲醇和7%的醋酸混合液脫色。用BIO-RAD凝膠成像儀拍照,并保存圖片。

1.3 數據處理

數據結果采用Excel與Origin進行處理。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的Ca2+-ATPase活性的影響

魚體中存在的肌球蛋白與肌動蛋白在ATP作用下生成肌動球蛋白,而肌球蛋白的重要生物活性之一就是具有Ca2+-ATPase活性。活性反映肌球蛋白頭部性質的變化,是魚肉在保鮮過程中蛋白質性質的一個重要指標,其活性值越高,說明蛋白質性質越穩定,變性程度越小。同時鈣離子ATP酶活力的大小反映了肌球蛋白分子完整性[14-15]。

由圖1可得出超高壓處理對大黃魚肌動球蛋白的影響顯著(p<0.05),肌動球蛋白的鈣離子ATP酶活性出現明顯改變。在保壓時間3 min下,樣品鈣離子ATP酶活性隨壓力上升呈現先增后減又增趨勢;在保壓時間6 min下,樣品鈣離子ATP酶活性隨壓力上升呈現先增后減趨勢;而9 min保壓時間下,樣品鈣離子ATP酶活性隨壓力上升呈現逐漸降低趨勢。在同一壓力下,在400 MPa壓力下隨著處理壓力時間的增加,鈣離子ATP酶活性隨保壓時間延長呈現逐漸降低趨勢;在300、350 MPa壓力下隨著處理壓力時間的增加,鈣離子ATP酶活性隨保壓時間延長呈現呈現先增后減趨勢。高壓過程中,過高的壓力使肌動球蛋白分子的表面結構有所改變,破壞了蛋白質原有的排列方式,使表現出來的鈣離子ATP酶活性降低。由于壓力越大,表面結構改變越大,400 MPa 9 min處理的樣品鈣離子ATP酶活性最低。

圖1 不同壓力及不同保壓時間作用下Ca2+-ATPase活性變化Table 1 Changes of Ca2+-ATPase activity under different pressure and pressure holding time

2.2 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的表面疏水性影響分析

表面疏水性屬于蛋白質的重要性質,對于維持蛋白質的穩定性和生物活性有著很大的作用[19]。疏水基團和極性溶液環境結合數目的指標是蛋白質表面疏水性,蛋白的表面疏水性是用來衡量蛋白變性程度的,這是因為它能夠反應蛋白位點在化學上或物理上的微妙變化,同時可以體現出蛋白表面疏水性氨基酸的相對含量[19]。表面疏水性在蛋白結構研究中是一個普遍的指標。一般認為由于氧化使得埋藏在蛋白天然構像內部的疏水性氨基酸殘基暴露出來,繼而提高了蛋白表面的疏水性。

由圖2可得出超高壓處理后大黃魚肌動球蛋白表面疏水性變化顯著(p<0.05)。在同一保壓時間下,隨著壓力增加,表面疏水性也隨之增加;在同一壓力下,隨著保壓時間增加,表面疏水性也隨之增加。但9 min 350 MPa以后,表面疏水性增加的趨勢有所減緩(p>0.05)。可能是由于超高壓過程中,過高的壓力破壞了蛋白質的表面結構,讓內部的疏水性基團暴露在蛋白質表面,破壞了蛋白質原有的排列方式和順序,提高了蛋白質表面的疏水性。同時,350 MPa的高壓處理時,蛋白質內部的疏水性氨基酸已經大部分暴露在蛋白質表面了,故400 MPa處理下表面疏水性增加趨勢有所減緩。壓力對疏水作用的影響可能主要是由于水化壓縮性之間的差量導致蛋白分子的展開[16]。疏水區域的暴露是大的肌球蛋白聚集體形成的先決條件。疏水基團在蛋白質發生凝聚時起了促進作用,促進方式主要是通過加強蛋白質之間的相互作用[15]。

2.3 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的活性巰基影響分析

絕大多數的巰基存在于半胱氨酸中,其是蛋白質結構的重要組成部分,也是生物體內一些氧化還原反應的基礎基團。蛋白質結構中兩個巰基脫氫形成的二硫鍵能使相鄰多肽得以連接,這一點在維持蛋白質完整結構上有著十分重要的意義,并且在一定程度上可以反映超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的變性情況[21]。

由圖3可以看出,超高壓處理對大黃魚肌動球蛋白的影響顯著(p<0.05),在同一保壓時間下,隨著壓力增加,活性巰基含量也隨之增加;在同一壓力下,隨著保壓時間增加,活性巰基含量也隨之增加。但350 MPa以后,活性巰基含量增加的趨勢有所減緩。可能是由于超高壓過程中,壓力促使蛋白質開始變性和展開,逐漸促進蛋白形成致密有序的三維網絡凝膠結構[23]。同時其在350 MPa高壓處理下,致密有序的三維網絡凝膠結構已經大致形成,故400 MPa處理下活性巰基含量增加趨勢有所減緩。肌動球蛋白在變性過程中發生了共價交聯,活性巰基大多數會脫氫形成雙硫鍵。此外,巰基脫氫形成雙硫鍵的反應,一定的條件下是可逆的[22]。Lanier等[23]報道二硫鍵的形成對魚糜凝膠有重要作用。由于肌動球蛋白中含有巰基的氨基酸在變性過程中形成二硫鍵,這對凝膠形成具有重要作用。

圖3 不同壓力及不同保壓時間作用下的活性巰基含量變化Table 3 Changes of active sulfhydryl content under different pressure and pressure holding time

2.4 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的蛋白質熱變性影響分析

超高壓處理會引起魚體中肌動球蛋白的變性,蛋白質發生變性其熱焓也會發生變化,采用差示掃描量熱儀(DSC)進行分析[15],DSC曲線中的吸收峰表示蛋白熱量被吸收,也是蛋白質的熱變性的過程,目標蛋白會呈現固定的吸收峰;峰值的變化、變性溫度的位移和消失可反映蛋白的變性情況。由此可根據DSC圖譜的變化推測蛋白構象的變化,進而得到超高壓處理后肌動球蛋白結構的穩定性。

如圖4所示,經超高壓處理后的的熱焓高于未處理組樣品,超高壓組按保壓變化時間長短由短到長分別在118、109、101 ℃時出現吸收峰,而空白組在147 ℃出現吸收峰,說明超高壓處理降低了肌動球蛋白的熱穩定性,超高壓處理破壞肌動球蛋白構象,導致變性溫度降低。

圖4 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的蛋白質熱變性影響分析Table 4 Effects of ultrahigh pressure treatment on protein thermal denaturation of cultured large yellow croaker actin

蛋白質的熱變的過程是一個吸熱的過程,通常情況為蛋白質吸收能量,內部氫鍵發生斷裂,其高級結構展開,破壞了原有的構象。從DSC曲線中能夠間接表現出蛋白質內部結構的變化情況,變性焓值和蛋白質的變性程度有著負相關的關系,變性焓值越小,變性程度就越大,反之亦然[24]。

2.5 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的SDS-PAGE電泳影響分析

肌動球蛋白并不是一種單一的蛋白,它是由肌動蛋白和肌球蛋白組合形成的復合體[24]。肌球蛋白分子中有6條肽鏈,其中有2條分子質量約200 kDa的重鏈(MHC)和4條分子質量約20 kDa的輕鏈(MLC);而肌動蛋白則較為簡單,其內部一般只有分子質量在45 kDa左右的單鏈多肽鏈。

由圖5可知,超高壓處理對肌動球蛋白影響明顯。與對照組相比,經過超高壓處理的樣品在200 kDa左右的條帶均有明顯變淡和變淺,說明超高壓破壞了肌球蛋白中的重鏈結構。隨著超高壓壓力的增加和保壓時間的延長,下部分子量較低的條帶各有不同程度的加粗和加深,說明在此區域內的蛋白有所增加,很有可能是因為超高壓破壞了肌動球蛋白分子的結構,將一部分的大分子蛋白破碎成小分子蛋白,總體分子量有所減少。

圖5 超高壓處理對養殖大黃魚肌動球蛋白的電泳圖Table 5 Electrophoresis of actin in cultured large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)by ultrahigh pressure treatment

3 結論

利用超高壓對養殖大黃魚肌動球蛋白進行處理,發現肌動球蛋白在不同的壓力和保壓下肌動球蛋白分子結構發生改變和破壞。隨保壓時間的增加和壓力的增大,大黃魚肌動球蛋白的鈣離子ATP酶活性整體呈下降趨勢,表面疏水性隨之增大,活性巰基含量增加,蛋白質熱變性變性焓值也隨之減少,蛋白質分子量有所下降。故超高壓能使肌動球蛋白發生聚集或斷裂,進而影響蛋白質生化特性。本文通過超高壓,研究肌動球蛋白在不同的壓力以及不同保壓的影響,以便為養殖大黃魚的貯藏和加工中提供理論依據,降低了獲取高質量凝膠的難度,更易得到優質的魚糜制品。