豆粉中大豆轉基因成分檢測能力驗證項目檢驗方法分析

□ 劉彥泓 楊 滴 大連市檢驗檢測認證技術服務中心

能力驗證已經成為實驗室質量控制的常用方法之一，其在確定實驗室檢測或校準能力方面具有不可替代的作用。中國合格評定國家認可委員會（CNAS）要求已認可的實驗室和申請認可的實驗室必須參加能力驗證活動。轉基因抗草甘膦除草劑（Roundup Ready? ）大豆（即轉基因大豆GTS-40-3-2）是目前種植面積和產量都很高的轉基因作物，實驗室開展此項目的檢測能力驗證，既可以提高實驗室的檢測技術能力與水平，也有利于提高實驗室對轉基因大豆進行監管的能力。

1 材料與試劑

1.1 試驗樣品

轉基因大豆GTS40-3-2樣品：中檢院NIFDC-PT-136豆粉中大豆轉基因成分測定能力驗證陽性樣品。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒（Magnetic DNA Purif ication System For Food），購自Promega公司；PCR反應試劑盒TaKaRa Ex Taq? DNA Polymerase、Premix Ex Taq ? （Probe qPCR），購自Takara Bio公司。

1.3 引物及探針序列

引物及探針購自Takara Bio公司，引物及探針序列見SN/T1195-2003[1]和GB/T19495.5-2018[2]。

2 方法

2.1 模板DNA的提取

采用Promega公司Magnetic DNA Purif ication System For Food試劑盒說明書進行提取。

2.2 PCR檢測

Ex Taq 0.25 μL，10×Ex Taq Buf fer 5 μL，dNTP 4 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA（50 ng/μL）2 μL， 補水至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃下5 min；94 ℃下 30 s，54 ℃下 40 s，72 ℃下60 s，40個循環；最后一次循環中，72 ℃下7 min。擴增結束后，對產物進行電泳，并記錄結果。

2.3 實時熒光PCR檢測

反應緩沖液10 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL， 探 針（10 μmol/L）1 μL，DNA（50 ng/μL）1 μL， 補 水 至 20 μL。擴增條件95 ℃保持10 min；95℃保持1 min，60 ℃保持30 s（讀取熒光），40個循環。擴增結束后，對產物進行電泳，并記錄結果。

2.4 實驗設置

每個PCR反應均設置2個平行實驗，并設置空白對照、陽性對照和陰性對照。

3 主要儀器

ABI實時熒光PCR儀（型號為QuantStudio 7Flex），購自賽默飛世爾科技有限公司；ABI PCR儀（型號為VERITI），購自賽默飛世爾科技有限公司。

4 結果及分析

4.1 PCR檢測結果

內源基因Lectin與外源基因CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS的檢測結果均為陽性，其PCR產物大小與預期大小基本一致，空白對照、陽性對照和陰性對照均符合要求，判定此樣品為轉基因大豆GTS40-3-2陽性。電泳結果見圖1。

圖1 PCR檢測結果

4.2 實時熒光PCR檢測結果

內源基因Lectin和GTS40-3-2品系特異基因檢測結果均為陽性，空白對照、陽性對照和陰性對照均符合要求，判定此樣品為轉基因大豆GTS40-3-2陽性。擴增圖見圖2。

5 結論與討論

筆者所在實驗室作為中檢院NIFDC-PT-136豆粉中大豆轉基因成分測定項目的技術合作實驗室，在樣品制備、樣品轉基因成分定性檢驗、樣品均勻性及穩定性檢驗等基礎性研究上做了大量的工作。對于轉基因大豆能力驗證樣品的檢驗，總結出幾點需要注意的地方。

圖2 實時熒光PCR檢測結果

5.1 避免污染

能力驗證發放的樣品一般為陰性和陽性樣品均有。由于樣品是經過粉碎過篩的大豆粉，其粉塵容易飄散，取樣過程不規范可造成不同樣品之間的污染。目前轉基因成分檢測方法中，PCR檢測方法的應用最為廣泛[3]。PCR檢測的優點是靈敏度高、操作簡便、快捷；缺點是操作不當容易造成污染，產生假陽性結果。PCR擴增時最主要的污染源是擴增產物，PCR擴增的終產物容易飛濺或形成氣溶膠，對實驗室環境、試劑、設備和衣物等造成污染[4]。因此檢測過程中避免污染非常重要。為保證結果準確，參加測試的實驗室應該在實驗室區域劃分、檢測過程質量控制等方面遵循規范性標準要求。核酸檢測實驗室應劃為5個區：試劑配制和貯存區、樣品制備區、PCR反應配制區、擴增區和擴增產物分析區。做好清潔消毒工作：定期對實驗室進行消毒，用75%的酒精擦拭移液器等小型設備；經常擦洗臺面、地面，做好衛生工作；加強實驗室空氣與大氣空氣的置換，從而凈化實驗室空氣；經常對實驗室進行長時間紫外燈照射，滅活空氣中的游離核酸片段。另外在實驗過程中應按標準要求設置陽性對照、陰性對照和空白對照，反映檢測過程是否存在污染。

5.2 模板DNA濃度和純度

模板的濃度和純度對目的基因的檢測來說是較為重要的[5]。通過紫外分光光度計可以測定模板DNA的濃度，并計算A260nm/A280nm的比值，在1.7～2.0比較好。通常情況下，建議PCR反應體系中模板的添加量為50～100 ng。

5.3 檢測方法的選取

目前現行有效的涉及轉基因大豆檢測方法的標準有很多：GB/T 19495.4-2018、SN/T 1195-2003、SN/T 1204-2016、SN/T 2668-2010、SN/T 1202-2010、NY/T 675-2003 及SN/T 1201-2014等。建議實驗室選擇本實驗室常用的檢驗方法進行檢驗。同時建議選擇兩種以上的方法進行比較后，得出結論。