藍莓葉內蘆丁含量的檢測

武玉祥 萬合鋒 封天洪 李永霞 文光琴 聶飛

摘要 [目的]充分利用藍莓葉資源，研究藍莓葉內藥效活性物質蘆丁的含量，建立一種檢測藍莓葉內蘆丁含量的方法。[方法]采集裁剪后的藍莓葉經清洗、水分晾干、低溫預冷凍、真空冷凍干燥、甲醇回流提取、過濾、甲醇定容后，采用高效液相色譜法測定蘆丁含量，色譜柱為Diamonsil RP-18e（250 mm×4.0 mm，5 μm），以乙腈-四氫呋喃磷酸水溶液（四氫呋喃/磷酸水溶液的體積比為5∶95，pH 3.0）為流動相，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長350 nm，進樣量20 μL。[結果]10個品種的藍莓裁剪葉內蘆丁的平均含量為11.52 mg/g，其中蘆丁含量最高的品種藍雨為12.837 mg/g，蘆丁含量最低的品種芭爾德溫為10.600 mg/g。蘆丁量在0.402 8～4.028 0 μg范圍內與峰面積呈現良好的線性關系。蘆丁平均回收率為98.41%，RSD為1.59%。[結論]裁剪后的藍莓葉內蘆丁含量豐富，該方法操作簡便、結果準確、精密度高、重現性好，可用于藍莓葉內蘆丁的含量檢測。

關鍵詞 藍莓葉;蘆丁;含量;檢測

中圖分類號 TS255.7文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.058

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]In order to make full use of the resources of blueberry leaves and research the content of rutin in blueberry leaves，a method for the determination of rutin in abandoned blueberry leaves was established.[Method]Gathering the cut blueberry leaves，and then cleaning，air drying，low temperature prefreezing;vacuum freeze drying，methanol circumfluence extraction，filtration，methanol constant volume，rutin content was determined by HPLC.The column was Diamonsil RP18e（250 mm×4.0 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitriletetrahydrofuran phosphoric acid solution （the volume ratio of tetrahydrofuran/ phosphoric acid solution was 5 μm，pH 3.0），the flow rate was 1mL/min，the column temperature was 35 ℃，the detection wavelength was 350 nm，the injection dose was 20 μL.[Result]The average content of rutin in cut leaves of 10 varieties of blueberry was 11.52 mg/g.The highest rutin content was 12.837 mg/g in Bluerain，and the lowest was 10.6 mg/g in Biloxi.There was good linear relationship when the content of rutin was in the range of 0.402 8-4.028 0 μg，respectively.The average recovery ratio of rutin was 98.41% and RSD was 1.59%.[Conclusion]The cut blueberry leaves are rich in rutin content.The method is simple，accurate，high precision and reproducible.It can be used to detect the quality of rutin in blueberry leaves.

Key words Blueberry leaves;Rutin;Content;Detection

基金項目 貴州省重大科技專項“山地藍莓產業關鍵技術研究與應用”（黔科合重大專項字〔2015〕6013）;貴州省平臺建設“貴州藍莓工程技術研究中心建設”（黔科合平臺人才〔2016〕5202號）;貴州省院合作專項“高叢藍莓產業化高效栽培技術研究及示范”（黔科院SY字〔2016〕03-1）;貴州科學院青年基金項目（黔科J合字〔2017〕14號）。

作者簡介 武玉祥（1985—），男，山東臨沂人，碩士，助理研究員，從事分子生物學研究。 *通信作者，研究員，從事小漿果種質資源培育、繁殖與栽培研究。

收稿日期 2019-01-10

藍莓，英文名：blueberry（Vaccinium Spp），雙子葉植物，屬杜鵑花科（vacciniaceae）越桔屬（Vaccinium），多年生落葉或常綠灌木[1]，其成熟果實為藍色，因富含多種營養物質和花青素等生物活性物質而備受廣大消費者喜愛，被聯合國糧農組織（Food and agriculture organization of the united nations）譽為“人類五大健康食品之一”[2]。目前對藍莓的研究主要集中在藍莓栽培、品種繁育、果實花青素及果實深加工等方面[3]。

近年來，隨著我國藍莓產業的迅速發展，對藍莓葉的研究也逐漸增多[2]，藍莓葉內富含多糖、原花青素、花色苷、黃酮類等多種生物活性物質和微量元素[4]，對藍莓葉的研究主要集中在葉內生物活性物質的提取、功能性飲料研發、藍莓葉鞣制茶等[5-6]，這些產品進入市場后反響較好[7]。但由于藍莓葉開發的產品主要以藍莓嫩葉、嫩芽作為原料，就藍莓而言[8]，為增加產量及果實質量（果粉厚度、果實顏色等），大多在定株時只保留3～5個主枝，樹心中空以保證透光性，目的是增加果實的產值，沒有過多的嫩葉、嫩芽可用于采摘[9-10]。嫩葉、嫩芽的采摘期主要集中在春季和夏季，這2個季節正是藍莓生長旺盛期，大部分的營養物質、養分等都是經光合作用、蒸騰作用等產生[11]，在這一時期采集嫩芽、嫩葉會減少植株整體葉片數量，進而降低光合作用速率和蒸騰作用能力，對植株生長和果實的發育造成不良影響[12]。每年藍莓采摘后1個月左右進入藍莓裁剪季節，大量的藍莓枝葉被丟棄或被焚燒，造成了資源浪費和環境污染[4]，被摒棄的藍莓枝上大多是健康的藍莓葉，可利用資源（生物活性物質）較多，其中黃酮類化合物蘆丁（Rutin）、蕓香苷等含量豐富，在藍莓葉內含量可達13.12 mg/g[1]，蘆丁及其合成物曲克蘆丁具有廣泛的藥理活性，可降低毛細血管的通透性和脆性，保持和恢復毛細血管彈性，臨床主要用于防治高血壓、腦溢血、糖尿病、視網膜出血和出血性紫癜等心腦血管疾病，也可用作食品抗氧化劑和色素[8]。

筆者對裁剪丟棄的藍莓枝條上的葉片進行蘆丁的提取并利用高效液相色譜法測定蘆丁的含量，旨在為藍莓葉的資源利用和藍莓葉內蘆丁藥材質量檢測方法的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

真空冷凍干燥機（LGJ-10N，北京亞星儀器科技有限公司）;高效液相色譜儀（U3000， 德國賽默飛世爾公司）;旋轉蒸發儀（Re-205，上海予華公司）;電子分析天平（ME104E，德國梅特勒托利多公司;ALC-210.4， 瑞士沙多利斯公司）;優普超純水儀（H03，成都優普有限公司）;電子調溫電熱套（98-1-B，天津泰斯特儀器有限公司）;循環水真空泵（SHB，鄭州長城科技有限公司）;超聲波清洗器（KQ-1000DE，昆山舒美公司）;電熱鼓風干燥箱（101-AB，天津泰斯特公司）;超低溫冰箱（DW-86L102，澳柯瑪公司）;研缽、pH計（PHS-25，上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

藍莓葉采自貴州省麻江縣瑞藍果業有限公司，采集時間為2018年9月中旬，采集裁剪藍莓枝葉，品種共10個，分別為藍雨（Blue-rain）、奧尼爾（ONeal）、密斯提（Misty）、夏普藍（Sharpblue）、萊格西（Legacy）、頂峰（Climax）、芭爾德溫（Baldwin-T-117）、早藍（Earliblue）、燦爛（Britewell）、粉藍（Powderblue），其中供試品是藍雨品種葉片。采集無病害、新鮮健康葉片。對照品來源：蘆丁對照品購自美國Sigma公司，純度 ≥ 96%;甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為去離子水（pH 7.2）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制。

1.3.1.1 對照品溶液。

精密稱取真空干燥至恒重的蘆丁對照品10.07 mg，置于25 mL的滅菌后烘干容量瓶中，加分析甲醇至刻度線，充分搖勻，得質量濃度為0.402 8 mg/mL的蘆丁標準品溶液，備用。

1.3.1.2 供試品溶液。將采摘的新鮮藍莓葉用滅菌去離子水沖洗干凈，在滅菌15 min后的超凈工作臺上晾干葉片表面水分，置于-60 ℃的超低溫冰箱中預凍12 h，然后轉入真空冷凍干燥機，真空度10 Pa，冷阱溫度-50 ℃，隔板加熱溫度25 ℃，連續干燥24 h至恒重，取出后迅速放入預冷研缽（研缽置于-20 ℃預冷30 min）快速研磨，粉末過50目篩，密封于50 mL離心管中再放入可封口樣品袋中，-60 ℃保存備用。精密稱量在干燥器中平衡過夜的藍莓葉粉末0.501 5 g，置于索氏提取器中，加入甲醇100 mL，55 ℃水浴加熱，回流提取3 h，將液體過濾，回收濾液，將濾液揮發，用甲醇定容到10 mL，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液備用。

1.3.2 方法學試驗。

1.3.2.1 色譜條件及系統適應性試驗。

選用 Diamonsil RP-18e（250 mm×4.0 mm，5 μm）色譜柱;以乙腈/四氫呋喃磷酸水溶液（四氫呋喃∶磷酸水溶液=5∶95，V/V，pH 3.0）為流動相，流速1.0 mL/min;進樣量 10 μL;柱溫35 ℃;檢測波長350 nm。在選定條件下，蘆丁與雜質峰基線分離，分離度（R）>1.5，蘆丁塔板數 >3 000。

1.3.2.2 蘆丁標準曲線的繪制。取質量濃度為0.402 8 mg/mL對照品溶液，按“1.3.2.1”色譜條件分別進樣1、2、4、6、8、10 μL測定峰面積，以峰面積（mAU）為縱坐標（y），以質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.3.3 精密度試驗。

取對照品溶液，連續進樣5次，每次10 μL，均按照“1.3.2.1”色譜條件測定峰面積，根據5次對照品峰面積計算相對標準偏差（RSD），要求RSD<3%。

1.3.4 穩定性試驗。取對照品溶液、供試品溶液各1份，室溫下分別放置0、2、4、12、24、48 h后，依“1.3.2.1”色譜條件測定峰面積，計算蘆丁峰面積的相對標準偏差（RSD），要求RSD<3%。

1.3.5 重復性試驗。

取藍莓葉6份，按照“1.3.1.1”樣品處理方法，按照“1.3.2.1”色譜條件，每份進2針，每針20 μL，計算蘆丁的含量及相對標準偏差（RSD），要求RSD<3%。

1.3.6 加樣回收率試驗。

根據線性范圍設計蘆丁含量高、中、低3種水平，精密吸取已測知蘆丁含量的藍莓葉適量，分低、中、高3個水平，每水平3份，再分別按要求精密加入一定量的對照品，按“1.3.2.1”測定蘆丁含量，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 方法學試驗結果

2.1.1 系統適應性。由圖1可知，蘆丁對照品在16.310 3 min處出現最大吸收峰，主峰峰形尖銳無雜峰;樣品密斯提在16.500 min處出現最大吸收峰，且主峰峰形尖銳，無雜峰;樣品藍雨、奧尼爾分別在16.510 2和16.620 2 min出現最大吸收峰，主峰峰形尖銳無雜峰。各樣品與對照品最大吸收峰時間十分接近，都在16.5 min左右，對照品和樣品分別進樣2針，峰形重疊良好。

2.1.2 蘆丁標準曲線繪制。按“1.3.2.1”色譜條件分別進樣1、2、4、6、8、10 μL，獲得蘆丁標準曲線方程為y=1 185.3 x+22.383，R2=0.999 9，表明蘆丁含量在0.402 8～4.0280 μ g范圍內線性關系良好，可用外標法進行測定和計算，標準曲線見圖2。

2.1.3 精密度。按照“1.3.2.1”色譜條件操作，蘆丁的RSD=1.36%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性。按照“1.3.2.1”色譜條件，獲得蘆丁的RSD=0.809%，表明樣品供試液在48 h內穩定。

2.1.5 重復性。按照“1.3.5”進行操作，獲得蘆丁RSD=1.48%，表明該方法具有較好的重復性。

2.1.6 加樣回收率。由表1可知，蘆丁的加樣平均回收率為98.41%，RSD值為1.59%，表明加樣回收率符合要求。

2.2 樣品中蘆丁含量的測定結果

取10個品種的藍莓葉，按照供試品溶液制備方法操作，每批平行操作2份，結果見表2。由表2數據可以計算得出，10個品種的藍莓裁剪葉內蘆丁的平均含量為11.517 5 mg/g。

3 結論與討論

藍莓富含多種營養成分和花青素、多酚、黃酮等生物活性成分，具有保護視力、提高免疫力、預防抑制癌癥等多種保健功效，因而備受廣大消費者歡迎[2]。截止到2018年，貴州省藍莓栽培總面積超過1.33萬hm2[13]，占全國藍莓種植面積的1/3，年產量3萬t，均居全國首位;產值20億元，帶動農民增收10億元，帶動旅游、運輸、冷藏、包裝等多行業發展，產業鏈總產值超過30億元。藍莓在貴州省經濟中占較大比重，是農民脫貧、致富的重要支撐產業[13]。

每年藍莓采摘后（9月份）進入藍莓修剪期，這一時期藍莓枝葉生長旺盛，近年來課題組調查發現，隨著貴州省藍莓種植規模擴大，大量的藍莓枝葉被堆積、丟棄、焚燒，造成了資源浪費和環境污染等問題，給藍莓種植戶和種植企業造成極大困擾，是目前藍莓產業中亟待解決的問題。蘆丁因具有較強的藥理活性，毒性低，具有抑制出血、治療輕度腹瀉、保護血管等作用[14]，在自然界植物中廣泛存在[15]，其中越桔屬植物藍莓，其葉內蘆丁含量豐富[2]，我國東北地區民間常用野生藍莓葉煮水治療腹瀉。

不同品種的藍莓枝葉中蘆丁的含量存在差異[11，16-17]，該試驗選取貴州地區主要栽培藍莓品種中的南高叢品種密斯提（Misty）、奧尼爾（O' Neal）、夏普藍（Sharpblue），北高叢藍莓品種早藍（Earliblue）、萊格西（Legacy），兔眼藍莓粉藍（Powderblue）、芭爾德溫（Baldwin-T-117） 、頂峰（Climax）、燦爛（Britewell）[5，18]，雜交品種藍雨（Blue-rain）為研究對象，測定不同品種藍莓葉內蘆丁含量，為開發藍莓葉蘆丁提供重要依據。研究表明：不同的干燥方式（熱風干燥、真空干燥、微波干燥、真空冷凍干燥等）對藍莓葉內蘆丁分離含量和抗氧化活性影響較大[8，19-21]，其中真空冷凍干燥獲得的蘆丁含量最高（10.20 mg/g），抗氧化活性最強。利用微乳液相色譜法分離測得藍莓葉內的蘆丁含量較高，達13.12 mg/g。該試驗選取最佳干燥方式中低溫、低氧分壓的真空冷凍干燥法分離藍莓葉內的蘆丁，保證了蘆丁的活性，采集裁剪后的藍莓葉，避免了資源的浪費和焚燒等不當處理帶來的環境污染。再采用索氏甲醇回流提取的方法，將溫度上限設置至55 ℃，減少蘆丁活性損失。經多次試驗，發現以乙腈/四氫呋喃磷酸水溶液（四氫呋喃/磷酸水溶液=5∶95，V/V，pH 3.0）為流動相，流速1.0 mL/min，進樣量 10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長350 nm時，出峰最多，峰形最佳[22]。

采用高效液相色譜法測定了10個品種藍莓葉內的蘆丁含量，平均值為11.52 mg/g，其中含量最高的品種藍雨為12.837 mg/g，含量最低的品種芭爾德溫為10.600 mg/g。通過該方法處理后，發現藍莓葉HPLC共有峰6個，可為藍莓葉HPLC指紋圖譜建立提供一定依據。該方法操作簡便、結果準確、靈敏，重現性、回收率均符合要求，可用于藍莓葉藥材質量的控制。

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