耐鹽彩葉杜梨莖尖繁育影響因素研究

王瑩 唐季云 李玉娟 談峰 郭聰 李敏

摘要 [目的]建立耐鹽彩葉杜梨的莖尖組培快繁技術體系。[方法]以耐鹽彩葉杜梨莖尖為試材，對影響莖尖離體培養的取材時期、外植體消毒、培養基和激素配比等因素進行研究。[結果]休眠期水培促萌發的嫩芽污染率較低，最利于莖尖誘導成活。采用正交試驗設計篩選出最佳滅菌處理為75%乙醇 +0.1% HgCl2 8 min，污染率和發芽率分別為27.36%和57.47%;適于莖尖增殖培養的培養基和激素組合為MS+1.0 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，增殖系數為9.23。[結論]通過耐鹽彩葉杜梨莖尖繁育技術的優化，為建立其優良無性系和進行遺傳轉化奠定基礎。

關鍵詞 耐鹽彩葉杜梨;莖尖培育;組織培養;快繁技術

中圖分類號 S604+.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0056-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.018

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Influencing Factors of Stem Tip Breeding of SaltTolerant? Pyrus betulaefolia

Abstract [Objective]To establish a rapid propagation technique system of stem tip tissue culture for salttolerant Pyrus betulaefolia.[Method] The stem tip of? Pyrus betulaefolia was used to study the influencing factors such as the period of sampling，the disinfection of explants，the medium and the ratio of hormones.[Result]The contamination rate of young shoots promoted by hydroponic culture in dormant stage was lower，which was most beneficial to stem tip induction and survival.The optimal sterilization treatment was 75% alcohol for 30s+0.1% HgCl2 for 8 min，and the contamination rate and germination rate were respectively 27.36% and 57.47%.The suitable multiplication culture medium and hormone combination for stem tip tissue was MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IBA，the multiplication coefficient was 9.23.[Conclusion]Through the optimization of stem tip breeding technology of salttolerant? Pyrus betulaefolia，it layed a foundation for establishing its excellent clone and genetic transformation.

Key words Salttolerant Pyrus betulaefolia;Stem tip culture;Tissue culture;Rapid propagation technology

杜梨為薔薇科梨屬落葉喬木，別名棠梨、灰梨、海棠梨等，原產我國北部，長江流域以及遼寧南部、河北、山西、河南、陜西、甘肅、安徽、江西、湖北均有分布，常生于海拔50～1 800 m的平原或山坡上[1]。杜梨是梨樹砧木中抗寒、抗旱、耐澇、耐鹽堿綜合抗性最強的砧木，對所有的白梨、砂梨、秋子梨系統品種具有親和力，為我國梨樹砧木最佳選擇[2]。與其他木本果樹一樣，由于杜梨的高度雜合性以及童期較長等特點，使常規育種周期較長。在田間繁殖也相對費時費力、占用較多土地[3]。隨著生物技術的不斷進展，杜梨的離體培養取得了長足進展，并為種苗工廠化及種質資源離體保存提供了有效途徑。筆者以杜梨為試材，采用正交設計法，獲得杜梨快速生長及擴繁培養基，旨在為建立其優良無性系和進行遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗材料為露地栽培于江蘇沿江地區農業科學研究所苗圃中的耐鹽彩葉杜梨。

1.2 外植體的采集與處理

以耐鹽彩葉杜梨的莖尖作為外植體，分別在3個不同時期進行取材：①休眠期枝條于溫室內水培催芽（S1）;②新梢生長初期頂端新芽（S2）;③盛花期的枝條頂端莖尖（S3）。

1.3 消毒滅菌

用細毛軟刷將枝條表面清洗干凈，剪取1.5 cm長的帶芽莖段，用洗潔精浸泡30 min，再用流水沖洗1 h以上，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒30 s，再分別用01%的HgCl2滅菌6、8、10 min，無菌水沖洗5～6遍接種到啟動培養基上，10 d后統計污染率，20 d后統計萌發率。培養基pH為57，培養溫度（25±2）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.4 叢生芽誘導和增殖培養

選取在啟動培養基上繼代3次以上生長健壯的無菌芽，接種到叢生芽誘導和增殖培養基中。設計L9（34）正交設計：6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），IBA（0.25、0.50、1.00 mg/L），NAA（0、0.2、0.4 mg/L），30 d后統計增殖系數及生長狀況。

1.5 壯苗生根

選擇生長健壯、長勢均一的叢生芽，轉接至壯苗生根培養基中。壯苗生根培養基用MS+（0.1、0.5、1.0） mg/L IBA，30 d后統計生根率、根數和生長狀況。

1.6 煉苗與移栽

將繼代培養45 d、高度超過3 cm、生長健壯、根系發育良好的無菌苗，在組培室中進行煉苗。首先去掉瓶子的橡皮筋煉苗2 d，然后將封口膜打開一半煉苗2 d，最后完全去封口膜煉苗7 d。煉苗結束后，取出組培苗，用無菌水將根系上的瓊脂清洗干凈，并用800倍的多菌靈浸泡15 min。移栽到草炭：珍珠巖=3：1（體積比）的混合基質中。移栽前，基質用高錳酸鉀消毒，放置一個晚上后使用，移栽后澆透水使基質和根部緊密結合，放置在25℃的人工氣候箱中培養7～14 d，之后放置在溫室內常規培養。

2 結果與分析

2.1 最佳取材時期的選擇

由表1可知，取材時間對莖尖的誘導效果有顯著差異。休眠期枝條于溫室內水培外植體與其他取材時期相比，莖尖污染率最低，而發芽率與成活率最高，成活率與其他各組差異達極顯著水平。盛花期的枝條頂端莖尖誘導效果較其他2組較差，污染率接近50%，發芽率僅為33.51%。對3次取材結果進行評價得出，污染率由低到高依次為休眠期枝條于溫室內水培催芽、新梢生長初期頂端新芽、盛花期枝條頂端莖尖。前2個時期取材，莖尖污染率相對較低，誘導成活率和發芽率較高，是較適宜的取材時期。

2.2 啟動培養

由表2可知，用HgCl2消毒不同時間，隨著滅菌時間的延長，污染率逐漸降低，相應的萌發率先升高后降低。綜合考慮污染情況和發芽結果，杜梨滅菌最適宜的方法為75%乙醇30 s，0.1% HgCl2滅菌8 min，此時的污染率為27.36%，發芽率為57.47%，其發芽率與其他滅菌方式差異達極顯著水平。

2.3 叢生芽誘導和增殖培養

由表3可知，高濃度IBA和NAA均能促進叢生芽的增殖生長，而過高濃度的6-BA對植株生長及叢生芽增殖不利，6-BA濃度1 mg/L時，隨著IBA濃度的增加，增殖系數升高。極差分析結果表明，叢生芽誘導和增殖培養效果影響因素由大到小依次為IBA、6-BA和NAA。6-BA與IBA的濃度比為1∶1時效果最好，明顯優于其他組合。最適宜誘導叢生芽的組合為1 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，此時的增殖系數為9.23，叢生芽長勢最好，葉色鮮艷（圖1）。

2.4 無菌苗生根培養

從表4可以看出，IBA在一定濃度范圍內均可誘導外植體生出不定根，但濃度過高會使平均生根數和平均根長降低，且3種濃度的IBA平均根長差異極顯著。但IBA濃度為1.0 mg/L時，誘導的不定根數較少，根系變粗且短，植株生長不良。IBA濃度為0.5 mg/L時，生根的數量最多且根長最長，為最適宜的生根濃度。

2.5 試管苗移栽

移栽后前7 d每天噴水2～3次，之后每天噴水1次，保持空氣濕度在80%左右，14 d后即可移出培養箱，直接放置在溫室中進行常規管理，移栽成活率達90%以上，之后在氣候合適時可移栽大田。

3 結論與討論

適宜的取材時期是降低莖尖污染率、提高莖尖誘導成活率的重要因素[4]。李艷霞等[5]在建立越橘品種‘Koralle莖尖繁殖體系中發現，利用休眠期水培后萌發出的嫩芽為外植體時，材料的污染最低。范世杰等[6]對3種越橘（桔）莖尖初代培養與增殖進行研究，結果表明不同取材時期莖尖污染率和誘導成苗率有很大差異。該試驗也獲得了相似的研究結果，用休眠期水培后萌發出的嫩芽可顯著降低接種的污染率，提高莖尖誘導成活率，為最適宜取材時期。新梢生長初期頂端新芽和盛花期的枝條頂端莖尖由于長時間暴露在室外，污染嚴重，接種后不易滅菌，導致污染率較高;另外莖尖頂端分生組織分化相對緩慢，以致于誘導成活率較低，應盡量避免這些時期取材。

在莖尖培養過程中，培養基是影響莖尖成活率以及苗木狀態的主要因素之一，當然，同一屬的不同種以及不同品種對培養基的反映有所不同，使用的培養基不能同一而論[7-9]。植物激素是影響莖尖誘導和增殖的關鍵因子之一，在組織培養中起重要作用。林靜等[10]利用杜梨子葉誘導不定芽，結果顯示，培養基和激素濃度對叢生芽誘導起關鍵性作用，而生長素NAA對愈傷組織的生長起主要作用。只有選用合適的激素及質量濃度，才能獲得理想的結果。該研究中對叢生芽誘導和增殖培養效果影響最大的是IBA，其次為6-BA，尤其6-BA與IBA的濃度比接近1時效果最好，這可能因品種的基因型而有所差異。

耐鹽彩葉杜梨作為一種新型的適合沿海灘涂利用的彩葉樹種，具有極高的觀賞價值和市場前景。該試驗以彩葉杜梨莖尖為外植體，初步建立了莖尖組培快繁技術體系，在保證生根成活率的同時，大大縮短了育苗周期，為實現耐鹽彩葉杜梨優質組培苗工廠化生產和規模化開發提供了參考。

參考文獻

[1] 張祺超，桂炳中，趙麗麗.華北地區鹽堿地杜梨栽培[J].中國花卉園藝，2018（10）：57.

[2] 劉振廷，牛鵬斐，潘文明，等.杜梨砧木苗二次移植培育嫁接苗技術探討[J].河北果樹，2018（2）：7-8.

[3] 張盼飛.中條山65份杜梨資源遺傳多樣性分析及矮化特性評價[D].太谷：山西農業大學，2016.

[4] 桂平.珍稀觀賞樹種紅豆樹組織培養技術研究[D].貴陽：貴州大學，2018.

[5] 李艷霞，劉忠玲，劉建明，等.越橘品種‘Koralle莖尖繁殖體系建立[J].東北林業大學學報，2018，46（3）：37-39，44.

[6] 范世杰，楊忠華，尹文龍，等.3種越橘（桔）莖尖初代培養與增殖研究[J].林業科技，2018，43（3）：5-9.

[7] 楊麗萍.卓尼縣馬鈴薯培養基制作與組織培養[J].農業科技與信息，2017（23）：93-94.

[8] 趙會芳，陳姣.不同培養基對勿忘我組織培養的影響[J].農技服務，2017，34（23）：42，41.

[9] 秦梅，張燕，徐美恩，等.甘薯莖尖脫毒及組培快繁技術[J].安徽農業科學，2014，42（32）：11238-11239，11258.

[10] 林靜，李疆，田嘉，等.杜梨子葉離體再生體系的建立[J].中國農學通報，2015，31（19）：41-47.