茂源鏈霉菌MTG基因pMA5載體的構建及鑒定

陸姣姣 朱婧 穆冬冬 姜紹通 鄭志

摘要 [目的]提高MTG產量并實現簡便有效的純化過程，以枯草芽孢桿菌為宿主構建pMA5mtg重組質粒。 [方法]通過提取茂源鏈霉菌的基因組DNA，擴增mtg基因片段，再將異源信號肽與mtg基因片段進行融合，融合片段和pMA5質粒雙酶切后連接，轉化到大腸桿菌感受態細胞中，菌落PCR和測序獲得陽性單克隆。然后將pMA5mtg重組質粒轉入枯草芽孢桿菌感受態中，通過抗性篩選和雙酶切鑒定獲取重組菌株。 [結果]成功擴增出mtg基因片段，構建出重組質粒pMA5mtg。 [結論]獲得pMA5mtg重組表達菌株，為MTG的純化及其未來生物工程的改造提供了有效的方法。

關鍵詞 MTG;信號肽;載體;枯草芽孢桿菌

中圖分類號 S188;Q785文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.030

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Construction and Identification of pMA5 Vector of Streptoverticillium mobaraensis MTG Gene

Abstract [Objective]In order to increase the MTG yield and achieve a simple and effective purification process，the recombinant vector pMA5mtg was constructed and expressed in Bacillus subtilis.[Method]The mtg gene fragment was amplified from the genomic DNA of Streptoverticillium mobaraensis，and the heterologous signal peptide was fused in front of the mtg gene fragment.The fusion fragment and the pMA5 vector were digested and ligated，and then transformed into E.coli competent cells.The positive strains were identified by PCR and extracted to check by DNA sequencing.The recombinant vector pMA5mtg was then transformed into the competent cells of B.subtilis，then the recombinant strain was obtained by resistance screening and double restriction enzyme digestion.[Result]The mtg gene fragment was successfully amplified，and the recombinant vector pMA5mtg was constructed.[Conclusion]The recombinant expression strain of pMA5mtg was obtained，which provided an effective method for the purification of MTG and its future bioengineering transformation.

Key words MTG;Signal peptide;Vector;Bacillus subtilis

微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶（MTG）可催化蛋白質間發生交聯，經其交聯的產品穩定性高，對蛋白酶降解和化學損害具有很高的抵抗力，因此，它們被廣泛應用于食品、紡織、材料工程等各個領域[1-3]。但MTG生產成本較高，純化過程復雜，限制了MTG的應用與發展[4-5]。

土壤微生物枯草芽孢桿菌是食品安全級菌株，具有高效的轉錄翻譯系統，分泌蛋白能力強[6]。筆者運用分子生物學技術構建基因工程菌，擴增mtg基因，與載體pMA5連接，轉入枯草芽孢桿菌中，獲得MTG重組表達載體，以進一步研究MTG在革蘭氏陽性菌中的表達及純化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料。茂源鏈霉菌（Streptoverticillium mobaraensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均購自中國微生物菌種保藏中心，再由合肥工業大學分子生物學實驗室培養保存。載體構建所用質粒pMA5，大腸桿菌DH5α。

1.1.2 主要試劑。

EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit（TransGen），EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（TransGen），EasyPure PCR Purification Kit（TransGen），EasyPure Quick Gel Extraction Kit（TransGen），T4-DNA Ligase（TransGen），Enzyme NdeI、NheI（TransGen），Taq DNA Polymerase（Sangon Biotech），FastPfu DNA Polymerase（TransGen），DNA Marker，Tryptone，Yeast extract，NaCl，Agar，Ampicillin，Kanamycin等。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌DH5α感受態的制備。

取1 mL過夜培養的菌液，轉接入100 mL新鮮LB培養基中，37 ℃、200 r/min培養至OD600為0.5～0.8，將培養液在冰上放置30 min，5 000 r/min、10 min、4 ℃離心收集菌體;用100 mL冷水重懸菌體，6 000 r/min、20 min、4 ℃離心去上清，如此漂洗3次;2 mL 10%甘油重懸菌體，7 000 r/min、10 min、4 ℃離心去上清;最后用0.5 mL 10 %甘油重懸菌體，然后將其分裝在1.5 mL EP管中，每管50 μL，-80? ℃保存備用。

1.2.2 枯草芽孢桿菌感受態的制備。接種枯草芽孢桿菌于3 mL LB培養基中，過夜培養。取2.6 mL過夜培養物接入40 mL（LB+0.5 mol/L山梨醇）中，37 ℃、200 r/min培養至OD600為0.85～0.95，將菌液冰水浴10 min，然后5 000 r/min、5 min、4 ℃離心收集菌體。用50 mL預冷的電轉培養基（0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10 %葡萄糖）重新吹懸菌體，5 000 r/min、5 min、4 ℃離心去上清，如此漂洗4次。將洗滌后的菌體吹懸于1 mL電轉培養基中，分裝在1.5 mL EP管中，每管50 μL ，-80? ℃保存備用。

1.2.3 質粒和基因組DNA的提取。

使用質粒DNA提取試劑盒和細菌基因組DNA提取試劑盒（TransGen）分別進行質粒和基因組DNA提取，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 mtg重組表達載體pMA5mtg的構建。

利用Clonemanager軟件設計引物，所用引物均在表1中列出。以B.subtilis 168基因組DNA為模板，用引物p1和p2擴增SPwapA信號肽基因片段，將NdeI位點添加到引物p1的5末端。以S.mobaraensis基因組DNA為模板，通過引物p3和p4擴增 mtg片段，將NheI位點添加到引物p4的5末端。引物p2和p3的5末端反向互補配對。再以SPwapA和mtg擴增子的混合物作為模板，用引物p1和p4通過融合PCR擴增片段SPwapA-mtg。將質粒pMA5與融合片段SPwapA-mtg分別進行NdeI和NheI雙酶切反應，酶切產物切膠回收，連接轉化至E.coli DH5α中，菌落PCR篩選陽性克隆，再將重組質粒提取進行測序。將測序正確的重組質粒轉入枯草芽孢桿菌中。

1.2.5 大腸桿菌的電轉化。

取出-80 ℃冰箱存儲的大腸桿菌DH5α感受態細胞，置于冰上解凍。解凍后，吸取2 μL質粒或連接產物加入到感受態細胞中，混勻，吸取至已預冷的0.2 cm電擊杯中，200 Ω、2.5 kV進行電擊，電擊后迅速加入1 mL無菌未加抗性的LB液體培養基，放在37 ℃搖床中低速振蕩培養1.5 h。待菌液混濁后，涂布于LB+氨芐霉素的平板上。平板倒置放于37 ℃培養箱中培養過夜。

從平板上挑取單菌落，進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的陽性克隆接種于LB+氨芐霉素的液體培養基中，培養過夜，提取質粒送去公司測序。

1.2.6 枯草芽孢桿菌的電轉化。

取出存儲于冰箱中的枯草芽孢桿菌感受態細胞，解凍。取2 μL質粒加入到感受態細胞中，混勻，吸取至已預冷的0.2 cm電擊杯中，200 Ω、2.5 kV進行電擊，電擊后迅速加入1 mL無菌未加抗性的RM培養基（LB+0.5 mol/L山梨醇+0.38 mol/L甘露醇），37 ℃搖床培養1.5 h至混濁。涂布于LB+卡那霉素的平板上，37 ℃培養過夜。

從平板上挑取單菌落，接種于LB+卡那霉素的液體培養基中，培養過夜，提取質粒，進行NdeI和NheI雙酶切驗證，所切條帶與理論大小一致時，再將質粒送去測序，最終獲得陽性重組菌株。

2 結果與分析

2.1 SPwapA信號肽的擴增

為了保證mtg基因在枯草芽孢桿菌中進行分泌表達，需要信號肽指導其分泌。以B.subtilis 168基因組DNA為模板，擴增SPwapA信號肽基因片段。電泳結果如圖1所示，SPwapA長度130 bp，與PCR所得片段大小一致。

2.2 S.mobaraensis mtg的擴增

以S.mobaraensis基因組DNA為模板，擴增mtg基因片段。電泳結果如圖2所示，mtg長度1 200 bp，與PCR所得片段大小一致。

2.3 SPwapA與mtg的融合

以SPwapA和mtg擴增子混合物作為模板，用引物p1和p4通過融合PCR擴增片段SPwapA-mtg。SPwapA片段長度為130 bp，mtg片段長度為1 200 bp，故融合片段SPwapA-mtg長度應為1 330 bp。電泳結果見圖3，融合片段1 330 bp比片段mtg略長，與PCR所得片段大小一致。

2.4 連接和大腸桿菌轉化后陽性克隆鑒定

質粒pMA5與融合片段SPwapA-mtg分別進行NdeI和NheI雙酶切反應，酶切產物切膠回收，再用T4連接酶連接，將連接產物轉化至E.coli DH5α中，過夜培養后挑取單菌落，進行菌落PCR驗證，使用引物p1和p4，擴增目的片段SPwapA-mtg，SPwapA長度130 bp，mtg長度1 200 bp。電泳結果如圖4所示，目的片段總長度1 330 bp，與PCR所得片段大小一致，說明片段SPwapA-mtg成功插入到載體pMA5上。將PCR鑒定正確的陽性克隆接種于LB+氨芐霉素的液體培養基中，培養過夜，提取質粒送去公司測序。

2.5 雙酶切驗證

將測序正確的pMA5mtg重組質粒轉入枯草芽孢桿菌中，在抗性平板上涂布并培養過夜，挑取單克隆接種于LB+卡那霉素的液體培養基中培養過夜，提取質粒，進行NdeI和NheI雙酶切驗證。電泳結果如圖5所示，重組質粒pMA5mtg經雙酶切作用后有2條清晰的條帶，較小的片段大小為1 300 bp左右，較大的片段為7 100 bp左右，與SPwapA-mtg大小（1 330 bp）和pMA5片段大小（7 107 bp）相符，且其DNA片段測序結果顯示所插入的序列完全正確。

3 討論

谷氨酰胺轉氨酶是催化蛋白質或多肽間發生共價交聯反應的轉移酶，可促進蛋白質凝膠化，在食品、醫藥、化妝品等領域有廣泛應用[7-8]。微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶是目前研究的熱點，但存在成本高、活力低、穩定性差等問題[9]。利用分子生物學技術對MTG基因進行改造并實現異源表達是目前最為有效的方法[10-11]。

該試驗通過基因工程技術在大腸桿菌中構建pMA5mtg重組載體，再將其轉入枯草芽孢桿菌中，從而獲得重組表達菌株。這為MTG在革蘭氏陽性菌中的表達研究提供了依據，同時也證明了枯草芽孢桿菌作為異源蛋白工業生產的宿主具有很大的潛力，是一個有意義的研究性課題。

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