維管束發(fā)育相關基因sm-Nvas對水稻稻瘟病抗性分析

張俊 盧衛(wèi) 譚艷平 劉學群 王春臺

摘要 [目的]探究煙草維管束發(fā)育相關基因sm-Nvas對水稻稻瘟病的抗性。[方法]構建pCAMBIA1305.1-sm-Nvas雙元表達載體，利用農桿菌介導的愈傷轉化法轉化水稻YTB，對轉基因陽性植株接種稻瘟病菌后進行抗性觀察。[結果]成功構建了pCAMBIA1305.1-sm-Nvas雙元超表達載體，獲得了轉sm-Nvas YTB植株。離體接種稻瘟病菌后轉基因植株的病斑比受體品種YTB的小。 [結論]轉sm-Nvas基因水稻具有稻瘟病抗性。

關鍵詞 維管束;sm-Nvas;稻瘟病;抗性

中圖分類號 S188文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0090-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis on Resistance of Tobacco Vascular Bundle Related Gene smNvas to Rice Blast

Abstract [Objective]To investigate the resistance of tobacco vascular bundle related gene smNvas to rice blast. [Method]A plant binary expression vector pCAMBIA1305.1smNvas was constructed， and transformed to recipient variety YTB by Agrobacteriummediated callus transformation. The resistance of the transgenic positive plant was investigated after inoculation with the rice blast fungi. [Result]The pCAMBIA1305.1smNvas binary overexpression vector was successfully constructed， and the transgenic YTB with smNvas was obtained. The scab of the transgenic plant was smaller than that of the receptor variety YTB after inoculation of rice blast fungi in vitro. [Conclusion]The transgenic rice with smNvas gene is resistance to rice blast.

Key words Vascular bundle;smNvas;Rice blast;Resistance

植物維管束是植物體內一種相互連通的系統(tǒng)，連接植物地下部和地上部，在支撐植物向上生長以及水分和營養(yǎng)物質的運輸上起到了關鍵作用[1]。許多病蟲害也能利用維管束系統(tǒng)在植物體內傳播，影響植物的生長發(fā)育[2]。維管束相關基因在維管束系統(tǒng)中特異表達，從而調節(jié)維管束生長發(fā)育，增強植物維管束病蟲害的防控能力[3-5]。楊澤峰等[6]發(fā)現(xiàn)水稻TAL基因在維管組織中特異表達，RNA干涉該轉基因植株水稻后，表型出現(xiàn)矮化和葉片卷曲易染病的特征。馬玲[7]發(fā)現(xiàn)水稻AVB基因啟動子在水稻維管束韌皮部特異表達，可應用于維管束疾病的防治。Singer 等[8]發(fā)現(xiàn)臍橙蔗糖合成酶1（CsSUS1p）啟動子可以驅動外源基因在維管束韌皮部表達，可應用于防治維管束疾病。Liu等[9]采用差異顯示技術，從煙草中分離得到一個受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導的基因序列，該基因啟動子使外源基因在維管束組織中特異表達[10]，命名為sm-Nvas。為了研究sm-Nvas基因在水稻中是否與病害的抗性相關，筆者以pCAMBIA1305為骨架構建sm-Nvas基因的超表達載體，并轉入水稻品種粵泰B（YTB）中，考察水稻中超表達sm-Nvas對水稻稻瘟病抗性的影響，以期為揭示該基因的生物學功能提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟病菌race007、水稻粵泰B（YTB）、W38型煙草、根瘤農桿菌EHAI05、載體pCAMBIA1305、載體PUD18-T均由中南民族大學武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供。rTaq酶、DNA分子質量Marker購買于TaKaRa公司;DNA引物合成由擎科生物技術有限公司（武漢部）完成。

1.2 儀器

FC5515R微型高速冷凍離心機（美國）;C1000 touch thermal cycler PCR儀（美國Bio-Rad）;Universal Hold Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)（美國）;SBD50-1 Heto-Holten水浴鍋（丹麥）;Nikon SMZ1500 Microscop熒光體式顯微鏡（日本）。

1.3 方法

1.3.1 植株表達載體的構建。

維管束發(fā)育相關基因sm-Nvas全序列參考文獻[9]，通過軟件分析并利用具有PmaC I和Nco I酶切位點引物擴增sm-Nvas基因全長。用PmaC I和Nco I雙酶切sm-Nvas基因PCR擴增產物和pCAMBIA1305.1載體質粒DNA，經(jīng)過電泳及回收，用T4 DNA連接酶連接質粒與目的片段（圖1），然后轉化到大腸桿菌中，提取質粒DNA用載體引物進行菌落PCR檢測，大小正確的質粒進一步進行測序鑒定。

1.3.2 根瘤農桿菌介導的遺傳轉化。

將構建成功的雙元表達載體電擊轉化農桿菌EHA105，篩選陽性農桿菌，用MS培養(yǎng)基將轉化成功的農桿菌懸浮培養(yǎng)到菌液濃度OD600約為0.5，將受體品種YTB種子誘導的愈傷組織在浸染液中浸染30 min，將干燥的愈傷組織轉移到共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，在篩選培養(yǎng)基暗培養(yǎng)20 d，轉移到分化培養(yǎng)基上光培養(yǎng)30 d左右，最后移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)15 d左右，煉苗并種植。

1.3.3 陽性植株的鑒定。

采用CTAB法進行DNA樣品抽提。取轉基因水稻葉片，加液氮后迅速研磨成粉末狀，加入65 ℃預熱的CTAB提取液并充分混勻，放入水浴鍋中1 h后至室溫，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻離心取上清液，加入2倍體積無水乙醇，混勻后冰浴。離心棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，沉淀自然風干后加TE溶解，-20 ℃保存。

利用引物HPTF226（序列為5-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-3）和HPTF697（序列為5-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3）進行潮霉素檢測。15 μL PCR反應體系包括1.5 μL 10×rTaq buffer、引物F和R（10 μmol/L）各0.25 μL、1 μL dNTP Mix（2.5 mmol/L）、0.1 μL? rTaq酶（5 U/μL）、1.5 μL DNA模板和10.4 μL去離子水。反應程序為94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠檢測。

1.3.4 轉基因水稻的種植及抗病性鑒定。

常規(guī)方法在溫室盆栽轉sm-Nvas水稻株系及對照品種粵泰B（YTB）。

取保存于-20 ℃的稻瘟病菌生理小種race007菌株于燕麥培養(yǎng)上活化后并擴大培養(yǎng)，待菌體覆蓋整個燕麥培養(yǎng)基表面后，除去白色菌絲置于紫光燈下培養(yǎng)產孢，配制孢子懸浮液，取水稻劍葉置于苯并咪唑濕潤濾紙上，將孢子懸浮液噴灑在水稻葉片上，保濕培養(yǎng)后觀察發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 sm-Nvas超表達雙元載體構建

將構建好的表達載體進行菌落PCR檢測，擴增出的目的條帶與預期大小相符的有泳道3、6、9共3個陽性克隆（圖2），進一步的測序結果表明超表達載體構建成功。

2.2 轉基因植株陽性鑒定

提取超表達sm-Nvas的轉基因植株基因組DNA進行潮霉素抗性基因檢測，陽性轉基因植株能擴增出特異條帶（800 bp左右），而對照組WT受體材料YTB沒有，圖3表明已成功獲得轉sm-Nvas的陽性植株。

2.3 轉sm-Nvas基因水稻抗性鑒定

當轉基因sm-Nvas水稻植株劍葉抽出來后，取劍葉與倒數(shù)第二葉進行稻瘟病菌race007離體接種，5 d后觀察的結果顯示陽性轉基因植株與對照組YTB相比，染病的病斑面積、寬度和長度明顯比對照組受體品種YTB的小（圖4）。

3 討論

越來越多的研究通過尋找合適的維管束相關基因來解決植物的病蟲害問題，Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)GbaVd1和GbaVd2基因在擬南芥中提高了轉基因株系維管束的木質化程度、增強了對大麗輪枝菌的抗性，表明GbaVd1和GbaVd2基因具有抗黃萎病功能。

該試驗通過構建一個pCAMBIA1305.1-sm-Nvas雙元表達載體，利用農桿菌介導成熟種子胚愈傷轉化水稻。在研究轉基因sm-Nvas水稻植株的抗性時，發(fā)現(xiàn)轉基因sm-Nvas在水稻中具有水稻葉瘟抗性特征，其抗性機理正在研究中。該研究結果為弄清sm-Nvas基因在植物體內的生物學功能提供了重要參考。

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